使用 Liberty Blue™ 和 Liberty PRIME™ 多肽合成儀可以快速、高純度進行頭尾環化肽的全自動合成。微波增強的多肽固相合成（SPPS）不僅有利于線性組裝，而且有利于隨后的環化步驟，在各種困難的生物學重要肽上實現了ji高的純度合成。Liberty PRIME 上使用的一鍋法 Fmoc SPPS 循環進一步改善合成時間、減少浪費。

表1 ：全自動合成首尾相連的環化肽

表2：Liberty Blue 和 Liberty PRIME 合成 Cyclorasin A¹

引言

環肽能夠橋接小分子和抗體之間的化學空間間隙，允許設計具有高結合親和力、顯著選擇性、低毒性和進入細胞內靶點的能力的分子²。因此，大環肽作為靶向傳統上無法成藥的生物靶點的治療劑具有相當大的前景³。截至 2017 年，超過 40 種環肽用于臨床⁴。環肽作為候選藥物開發的這一令人鼓舞的趨勢，為發展更穩健的制備方法提供了動力。

SPPS 可以通過使用 Fmoc-Glu-ODmab 作為 C 端氨基酸 (圖 1) 制備首尾相連環化肽。在合成線性肽骨架后，可以使用稀肼溶液選擇性地去保護 Dmab 基團。之后，可以使用微波增強偶聯實現首尾環化。將微波能量應用于首尾環化肽的合成可以實現更有效的偶聯，從而加快合成時間和提高純度 (CarboMAX™)⁵。

圖 1：Fmoc-Glu-ODmab ( 左 ); 

Fmoc-Glu(Wang resin LL)- ODmab (右)

材料與方法

試劑

以下含有zhi定的側鏈保護基團 Fmoc 氨基酸購自 CEM Corporation (Matthews, NC) 并：Ala、Arg (Pbf)、Gly、His (Boc)、Ile、Leu、Lys (Boc)、Thr (tBu) )、Trp (Boc)、Tyr (tBu) 和 Val。Rink Amide ProTideTM LL 樹脂也購自 CEM Corporation。Fmoc-Glu-ODmab、Fmoc-Glu(Wang)-ODmab LL 樹脂、FmocD-Ala- OH 和 Fmoc-4-氟-L-苯丙氨酸購自 EMD Millipore (Burlington, MA)。Fmoc-D-2-Nal-OH、FmocD-Nle-OH 和 Fmoc-N-甲基-L-苯丙 氨酸購自 Bachem (T orrance, CA)。Fmoc-N-甲基-異亮氨酸-OH 購自 Advanced ChemTech (Louisville, KY)。FmocN-甲基-亮氨酸-OH 購自 Alfa Aesar (Haverhill, MA)。水合肼、N,N-二異丙基乙胺(DIEA)、Fmoc-N-甲基-甘氨酸-OH、N,N'-二異丙基碳二亞胺 (DIC)、哌啶、吡咯烷、三fu乙suan (TFA)、3,6-dioxa-1、 8 辛二硫醇(DODT) 和三異丙基硅烷 (TIS) 購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、無水乙mi (Et2O) 和乙酸購自 VWR (Radnor, PA)。LC-MS 級水 (H2O) 和 LC-MS 級乙腈 (MeCN) 購自 Fisher Scientific (Hampton, NH) 。

多肽合成：CEM 7-mer, cyclo-[GVYLHIE] 

使用 CEM Liberty Blue 自動微波多肽合成儀，在 Fmoc- Glu(Wang)- ODmab 樹脂（離子交換容量：0.025 meq/g）上，以 0.10 mmol 的規模合成（Dmab 脫保護以0.05 mmol 規模進行，首尾環化以 0.025 mmol的規模進行）。使用 DMF 中的哌啶進行脫保護。

偶聯反應在5倍量的Fmoc氨基酸,DIC和Oxyma Pure(CarboMAX)⁵ 中進行。使用肼的 DMF 溶液進行 ODmab 基團的脫保護。首尾環化反應使用 DMF 中的 DIC/HOBt 進行。在 CEM RazorTM 高通量多肽切割系統中使用 TFA/H2O/TIS/DODT 進行切割。裂解后無水乙mi沉淀肽并過夜凍干。

圖2：CEM 7-mer

使 用 CEM Liberty Blue 自 動 微 波 多 肽 合 成 儀 ， 在 Rink Amide ProTide LL 樹脂 (離子交換容量：0.19 meq/g ）上，以 0.05 mmol 的規模合成（Dmab脫保護以 0.05 mmol 的規模進行，首尾環化以 0.025 mmol 的規模進行）。使用 DMF 中的哌啶進行脫保護。偶聯反應在5倍Fmoc氨基酸、DIC和Oxyma Pure(CarboMAX)⁵中進行。Fmoc-Glu-ODmab 用做第一個氨基酸（Q）。使用肼的 DMF 溶液進行 ODmab 基團的脫保護。首尾環化反應使用 DMF 中的 DIC/HOBt 進行。在 CEM RazorTM 高通量多肽切割系統中使用 TFA/H2O/TIS/DODT 進行切割。裂解后用無水乙mi沉淀肽并過夜凍干。

多肽合成：Cyclorasin A, cyclo-[WTaRRR-nal-R-Fpa-nle-Q](Liberty PRIME)

使用 CEM Liberty PRIME 自動微波多肽合成儀，在  Rink Amide ProTide LL 樹脂（離子交換容量：0.19 meq/g）上，以 0.05 mmol 規模合成（Dmab脫保護以 0.05 mmol 的規模進行，首尾環化以 0.025 mmol 的規模進行）。使用 DMF 中的吡咯烷進行脫保護。偶聯反應在5倍 Fmoc 氨基酸、DIC和Oxyma Pure(CarboMAX)⁵中進行。Fmoc-Glu-ODmab 用做第一個氨基酸（Q）。使用肼的 DMF 溶液進行 ODmab 基團的脫保護。使用肼的 DMF 溶液進行 ODmab 基團的脫保護。首尾環化反應使用 DMF 中的 DIC/HOBt 進行。在 CEM RazorTM 高通量多肽切割系統中使用 TFA/H₂O/TIS/ DODT 進行切割。裂解后用無水乙mi沉淀肽并凍干過夜。

圖3：Cyclorasin A

使用 CEM Liberty PRIME 自動微波肽合成儀在 Fmoc-Glu (Wang ) -ODmab 樹脂（離子交換容量：0.25 meq/g ）上以 0.05 mmol 的 規模合成（Dmab 脫保護以 0.05 mmol 規模進行，首尾環化以 0.025 mmol 的規模進行）。使用 DMF 中的吡咯烷進行脫保護。偶聯反應在5倍 Fmoc 氨基酸、DIC和Oxyma Pure（CarboMAX）⁵中進行。使用肼的 DMF 溶液進行 ODmab 基團的脫保護。首尾環化反應使用 DMF 中的 DIC/HOBt 進行。在CEM RazorTM高通量多肽切割系統中使用 TFA/H2O/TIS/DODT 進行切割。裂解后用無水乙mi沉淀肽 并凍干過夜。

圖4：N-Methyl Cyclorain Analog

使 用 CEM Liberty PRIME 自 動 微 波 肽 合 成 儀 在 Fmoc-Glu (Wang )-ODmab 樹脂（離子交換容量：0.25 meq/g ）上以 0.1 mmol 的規模合成（Dmab 脫保護以 0.05 mmol 規模進行，首尾環化以 0.025 mmol 的規模進行）。使用 DMF 中的吡咯烷進行脫保護 。偶 聯 反 應 在 5 倍 Fmoc 氨 基 酸 、 DIC和Oxyma Pure（CarboMAX）⁵中進行。使用肼的 DMF 溶液進行 ODmab 基團的脫保護。首尾環化反應使用 DMF 中的 DIC/HOBt 進行。在 CEM RazorTM 高通量多肽切割系統中使用 TFA/H2O/TIS/DODT 進行切割。裂解后用無水乙mi沉淀肽并凍干過夜。

圖5： Poly N-Methyl Peptide

在配備有 PDA 檢測器的 Waters Acquity UPLC 系統上分析肽， 該 檢 測 器 配 備 Acquity UPLC BEH C8 柱 （1.7 mm 和 2.1 x 100 mm）。UPLC 系統連接到 Waters 3100 Single Quad MS 用于結構測定。在 Waters MassLynx 軟件上進行峰分析。使用 (i) H2O 和 (ii) MeCN 中的 0.05% TFA 梯度洗脫進行分離。

結果

在 Liberty Blue 自動微波肽合成儀上 CEM 7-mer 的微波增強固相合成產生了純度為 78% 的目標肽（圖 6）。

圖6：CEM 7-mer 的UPLC色譜圖

在 LibertyBlue 自動微波肽合成儀上的 Cyclorasin A的微波增強。

圖7：Cyclorasin A (Liberty Blue)的UPLC的色譜圖

Liberty PRIME 自動微波肽合成儀上的 Cyclorasin A 微波增強。

圖8：Cyclorasin A (Liberty PRIME)的UPLC色譜圖

Liberty PRIME 自動微波肽合成儀上的 Poly N-Methyl Peptide。

圖9：多聚N-甲基Peptide 的UPLC色譜圖

Liberty PRIME 自 動 微 波 肽 合 成 儀 上 的 N-Methyl Cyclorasin Analog 的微波增強固相合成產生了純度為 66% 的目標肽（圖10）。

圖10：N-甲基 CyclorasinAnalog的UPLC色譜圖

結論

使用自動微波增 SPPS 可以快速有效地合成首尾環肽。此外，易于使用的 Liberty Blue 和 Liberty PRIME 軟件允許對肽序列進行快速直接的編程。使用 Liberty Blue 肽合成儀在 2 小時 13 分鐘內合成了純度為 78% 的 7 聚體環肽。在 Liberty Blue 上在 3 小時 1 分鐘內以高純度 (75%) 合成了 Cyclorasin A 環肽。在 Liberty PRIME 上僅用了 2 小時就合成了相同的肽，純度很高 (75%)，浪費大約 100 mL。在 Liberty PRIME 上，微波增強的 SPPS 可在 2 小時 5 分鐘內以 66% 的純度合成了具有綜合挑戰性的 N-methyl cyclorasin analog 環肽。后，在 Liberty PRIME 上以 73% 的純度在 2 小時 12 分鐘內制備出多聚 N-甲 基化 11 聚體肽。 

參考文獻

[1] Upadhyaya, P.;Qian, Z.; Selner, N. G.; Clippinger, S. R.; Wu, Z.; Briesewitz, R.; Pei, D. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2015, 54 (26), 7602–7606. 

[2] White, A. M.; Craik, D. J. Expert Opin. Drug Discov. 2016, 11 (12), 1151–1163.

[3] Hurtley, S. M. Science. 2018, 361 (6407), 1084.4-1085. (4) Zorzi, A.; Deyle, K.; Heinis, C. Curr. Opin. Chem. Biol. 2017, 38, 24–29. (5) CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperature.”