冷凍干燥技術(shù)解決mRNA-LNP疫苗儲運難題

mRNA是一種很有吸引力的疫苗方式，它在抗原設(shè)計上的靈活性以及開發(fā)和生產(chǎn)的速度，使得mRNA疫苗成為一種極為重要且經(jīng)濟效益巨大的干預手段。2020年的疫情使得mRNA疫苗和藥物受到廣泛關(guān)注，Moderna和Pfizer/BioNTech迅速開發(fā)出非常有效的核苷修飾mRNA-LNP疫苗，采用LNP作為運輸載體，并帶動了mRNA領(lǐng)域研究的蓬勃發(fā)展。

                               圖1：多款Corona Virus Disease 2019 mRNA 疫苗采用LNP

            【來源：International Journal of Pharmaceutics，國金證券研究所】

小德在往期的文章“冷凍干燥技術(shù)助力新型mRNA疫苗研發(fā)與生產(chǎn)”中介紹了mRNA疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)，今天帶大家了解一下mRNA疫苗的遞送技術(shù)LNP。

遞送mRNA有效的常用載體—LNP

mRNA分子量大、親水性強，但自身的單鏈結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，易被降解。mRNA的有限壽命使細胞能夠快速改變蛋白質(zhì)合成以響應(yīng)其不斷變化的需求，卻難以滿足成藥性的要求。加上mRNA分子本身攜帶負電荷，難以穿過表面同為負電荷的細胞膜，所以需要特殊的修飾或包裹遞送系統(tǒng)才能實現(xiàn)mRNA藥物的胞內(nèi)表達，因此，遞送技術(shù)是mRNA公司的核心技術(shù)之一。

遞送mRNA疫苗的手段有物理方法、病毒載體方法和非病毒載體方法。脂質(zhì)體及其衍生物已成為目前遞送mRNA非常有效的非病毒載體。用于遞送mRNA疫苗的脂質(zhì)載體主要分為以下幾種：脂質(zhì)體復合物（LP），脂質(zhì)體聚合物（LPR），脂質(zhì)體納米粒（LNP），陽離子納米乳（CNE）。

脂質(zhì)體納米粒（LNP）是mRNA藥物常用的載體。LNP是一種多組分系統(tǒng)，通常由可電離脂質(zhì)或陽離子類脂質(zhì)化合物、輔助脂質(zhì)、膽固醇、保護劑聚乙二醇-脂質(zhì)共軛物組成。其作用是確保長鏈核酸分子的壓實，保護其在細胞外酶的作用下不降解，并提供由于內(nèi)吞作用（吞噬作用或胞吞作用），而將納米顆粒轉(zhuǎn)運到細胞中，隨后將mRNA從內(nèi)體（吞噬體）釋放到細胞質(zhì)中，用于翻譯和表達具有免疫原性表位的蛋白質(zhì)。

            圖2：LNP結(jié)構(gòu)組成

           【來源：Science】

每種LNP都由4種輔料構(gòu)成，包括可電離脂質(zhì)（與mRNA結(jié)合，將其電荷由負電荷轉(zhuǎn)化為電中性，同時限制顆粒毒性）；另3種脂質(zhì)可以維持粒子的結(jié)構(gòu)并提高穩(wěn)定性。

用LNP將mRNA包封，從而保護LNP中的mRNA，還可解決mRNA疫苗穩(wěn)定性差的問題。為了疫苗能有效地進行流通，我們期望mRNA-LNP疫苗好能夠在冷藏溫度（2-8°C）或更高的溫度下有足夠長的有效期。目前，公開資料中幾乎沒有關(guān)于mRNA-LNP 制劑長期儲存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。Moderna和BioNTech/輝瑞的Corona Virus Disease 2019疫苗分別需要在-15~-25℃和-60~-90℃儲存。mRNA-LNP 需要冷凍儲存，對疫苗在運輸、儲存和流通是個很大的挑戰(zhàn)。當前迫切需要研發(fā)出性質(zhì)更加穩(wěn)定不需要冷凍儲存的mRNA-LNP疫苗。

賓夕法尼亞大學與德國BioNTech學者共同在Molecular Therapy發(fā)表過一篇文章：Lyophilization provides long-term stability for a lipid nanoparticle-formulated, nucleoside-modified mRNA vaccine。

                                圖3：Molecular Therapy研究文章

用SP Scientific VirTis Genesis 35L Pilot Lyophilizer凍干機（見圖4），對脂質(zhì)納米顆粒為載體的修飾核苷酸mRNA疫苗進行了穩(wěn)定性研究。研究發(fā)現(xiàn)核苷酸修飾mRNA-LNP疫苗室溫儲存12周和4℃儲存至少24周物理化學性質(zhì)沒有顯著變化。小鼠研究中表明，螢火蟲熒光素編碼的凍干劑型mRNA-LNP依舊可以高水平表達，在室溫儲存12周或4℃儲存至少24周后，未觀察到編碼HA的mRNA-LNP疫苗的免疫原性降低。

該研究為克服核苷修飾mRNA-LNP疫苗的長期儲存難題提供了一個潛在的解決方案。

  圖4：SP ScientificVirTisGenesis35LPilotLyophilizer凍干機

瑞科吉生物的凍干劑型mRNA-LNPCorona Virus Disease 2019疫苗采用LNP遞送系統(tǒng)，應(yīng)用自主開發(fā)的冷凍干燥技術(shù)實現(xiàn)了4℃和25℃條件下的制劑穩(wěn)定性。該疫苗可在常規(guī)冷鏈條件下貯存與運輸，顯著提高了疫苗的可及性。研究成果已在 bioRxiv 在線發(fā)布，題為Lyophilized mRNA-lipid nanoparticle vaccines with long-term stability and high antigenicity against SARS-CoV-2。

作為初款凍干mRNA疫苗，若該疫苗能夠順利通過臨床成功上市，將對改變疫苗分發(fā)不均、Corona Virus Disease 2019疫情持續(xù)肆虐的困局起到關(guān)鍵作用。

                           圖5：瑞科吉生物疫苗研究成果

凍干疫苗的優(yōu)勢及工藝開發(fā)，請移步往期文章“冷凍干燥技術(shù)助力新型mRNA疫苗研發(fā)與生產(chǎn)”。

mRNA-LNP疫苗的長期儲存解決方案

SP Scientific 研發(fā)及生產(chǎn)型凍干機

關(guān)于mRNA-LNP疫苗的一些問題

問：如何準確實現(xiàn)凍干mRNA-LNP疫苗中關(guān)鍵配方溫度測量？

                        圖6：凍干顯微鏡Lyostat5及搭配使用的DSC模塊

英國Biopharma Group公司提供的凍干顯微鏡Lyostat5及可與顯微鏡搭配使用的DSC模塊，可以輕松實現(xiàn)配方關(guān)鍵溫度（Tc, Teu, Tg’)的測量。

問：如何快速實現(xiàn)mRNA-LNP凍干工藝開發(fā)和優(yōu)化？

SP Scientific提供的Lyostar凍干機僅需運行一個遁環(huán)即可自動摸索和開發(fā)凍干工藝。結(jié)合前沿的凍干PAT技術(shù)（Smart 全自動工藝開發(fā)技術(shù)，Controlyo晶核控制技術(shù)，TDLAS實時水蒸汽測量技術(shù)），使漫長復雜的工藝摸索變得簡單快捷有效。

         圖7：Lyostar 全智能凍干工藝開發(fā)與優(yōu)化

問：是否有凍干mRNA-LNP疫苗的案例？

輝瑞、莫德納，阿斯利康、強生均已在使用SP Scientific Lyostar智能工藝開發(fā)凍干機進行Corona Virus Disease 2019凍干疫苗的研發(fā)。