Oligo賽道想超車，純化干燥工藝如何選擇？

隨著寡核苷酸的應(yīng)用越來越廣泛，不少企業(yè)相繼加入寡核苷酸合成的賽道。想得到優(yōu)質(zhì)高純度的核酸不是一件簡單的事，寡核苷酸的合成通常會導(dǎo)致不可避免的雜質(zhì)積累，它們可能會與全長產(chǎn)品競爭，或者抑制反應(yīng)，因此選擇高效率高質(zhì)量的純化和干燥工藝是很有必要的。那么對于工業(yè)級別的寡核苷酸純化，一般又有哪些方法呢？且聽小編跟您慢慢分享。

寡核苷酸的應(yīng)用

Oligo即寡核苷酸鏈，分子實(shí)驗(yàn)室常用的PCR引物、NGS捕獲探針、qPCR探針和FISH探針等都是寡核苷酸。除了引物探針以外，還可作為核酸藥物用于遺傳疾病、腫瘤、病毒感染和感覺器官等疾病的治療或預(yù)防。

探針及引物主要用于IVD試劑盒，面對需求量巨大的檢測試劑盒，上游原材料的質(zhì)量和供應(yīng)速度應(yīng)該同幅度進(jìn)步和增長，在引物和探針的制備過程中，提高生產(chǎn)效率以及產(chǎn)物純度更是重中之重。

純化方式

對于不同的寡核苷酸鏈，應(yīng)該如何選擇合適的純化方法？下面列舉了幾種常見的純化方法。

DSL（脫鹽）純化

利用反相C-18層析柱進(jìn)行脫鹽，它對DNA有特異性的吸附，一些雜質(zhì)，如氨、鹽，不能被吸附，所以能有效地去除鹽分等雜質(zhì)。該方法不能有效去除比目的DNA短的小片段，所以適用于要求較低的PCR普通引物。

圖1：DSL純化制備流程圖

OPC純化

根據(jù)DNA保護(hù)基（DMTr基）和Cartridge柱中樹脂間的親合力作用的原理進(jìn)行純化目的DNA片段。該方法得到目的DNA的純度能達(dá)到95%以上,但受柱容量影響，適用于40mer以下的普通引物。

圖2：OPC純化制備流程圖

PAGE純化聚彬稀酰胺凝膠電泳

使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對引物DNA進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于90%，對長鏈(大于50mer)普通引物的純化特別有效。

圖3：PAGE純化制備流程圖

HPLC高效液相色譜法

根據(jù)寡核苷酸的疏水性對DNA片段進(jìn)行純化分離，該方法能達(dá)到很高的純度和靈敏度，可以有效去除N-1短片段，目標(biāo)DHA的純度大于95%。適用于對純度要求高的短鏈（小于40 mer）普通引物、修飾引物，尤其適合及熒光標(biāo)記探針的純化。

若想得到純度很高的寡核苷酸片段，HPLC法也常被用于與其他方式雙重聯(lián)合（如HPLC_PAGE、HPLC_CE、2xHPLC等）。

圖4：HPLC純化制備流程圖

引物干燥過程中的質(zhì)量控制考慮

引物合成純化后都會產(chǎn)生一定的有機(jī)溶劑（如乙腈、甲醇、水等），需要采用真空離心濃縮設(shè)備將寡核苷酸干燥成干粉狀，一般包裝至EP管或者96孔板中。

圖5：引物生產(chǎn)流程

作為分子診斷qPCR試劑盒中的核心原料，qPCR引物及Taqman探針的質(zhì)量直接影響了靶標(biāo)檢測的準(zhǔn)確性，所以選擇干燥工藝也十分關(guān)鍵，在干燥過程的質(zhì)量控制需盡考慮以下幾個方面：

樣品保護(hù)和溫度控制

在寡核苷酸的干燥過程中，盡量避免加熱源直接照射在樣品上而導(dǎo)致樣品局部過熱。紅外加熱模式，不直接加熱樣品，這樣確保了樣品的溫度不會高于樣品支架的溫度，保證了樣品的安全。SampleShield溫度控制系統(tǒng)，采用非接觸式溫度探測用以在整個離心過程中，檢測樣品和離心腔的溫度變化，確保整個蒸發(fā)過程受到質(zhì)控。

避免交叉污染

由于溶劑蒸發(fā)的過程中，低沸點(diǎn)溶劑和混合溶劑容易產(chǎn)生暴沸而導(dǎo)致樣品損失和交叉污染，這會直接影響樣品純度。Dri-Pure防爆沸技術(shù)，控制真空度下降梯度和施加500g的離心力，讓用戶處理96孔板或384孔板等密集型容器時，無需擔(dān)心樣品交叉污染。

高通量

選用通量高、干燥效率快的干燥手段對寡核苷酸的制備過程事半功倍，GeneVac濃縮儀可批量處理樣品：一次可以處理幾百個甚至上千個樣品，全系列產(chǎn)品都有專門適配EP管和96孔板的鋁制實(shí)心轉(zhuǎn)子。如HT-12一次可以濃縮384個1.5ml EP管或24塊96孔板，大大提高了研發(fā)和生產(chǎn)效率。

自動停機(jī)

在制備大量的寡核苷酸樣品時，無需值守的自動停機(jī)功能派上用場，使寡核苷酸樣品干燥后立即自動停止蒸發(fā)，為核酸樣品提供雙重保護(hù)機(jī)制。

應(yīng)用案例

WTCHG（牛津大學(xué)人類遺傳學(xué)威康信托中心)使用Sequenom MassARRAY®SNP基因分型系統(tǒng)用于SNP分析，樣品前制備過程分別使用風(fēng)干（左）和Genevac?EZ-2真空離心濃縮儀（右）干燥含有寡核苷酸樣品的384孔板。

下圖結(jié)果表明，使用EZ-2真空離心濃縮儀干燥寡核苷酸樣品，可以大大降低樣品降解率，保證樣品不會被污染，消除了樣品損壞的潛在來源。

圖6：在空氣干燥(左)和EZ-2蒸發(fā)器干燥(右)后的序列樣品質(zhì)量分析

*深綠色-高樣本數(shù)據(jù)質(zhì)量

*淺綠色-中等樣本數(shù)據(jù)質(zhì)量

*紅色-樣品質(zhì)量差或無數(shù)據(jù)

圖7：空氣干燥(左)和EZ-2蒸發(fā)器干燥(右)后的SNP分析

Genevac真空離心濃縮儀

離心濃縮作為IVD原料合成制備的關(guān)鍵技術(shù)之一，具有通量高、干燥效率高、保護(hù)樣品等特點(diǎn)，真空離心使?jié)饪s過程都保持在較溫和的環(huán)境中，提高寡核苷酸的產(chǎn)品純度與收率，在工藝選擇開發(fā)和放大中建立良好的工藝空間。

一臺高通量真空離心濃縮儀就可以做到濃縮干燥一步到位，可以直接作為生產(chǎn)設(shè)備投入到生產(chǎn)中，縮短整個Oligo制備過程，例如上述實(shí)驗(yàn)中所提到的Genevac?EZ-2真空離心濃縮儀。這邊我們?yōu)榇蠹彝扑]下面幾款Genevac旗下的真空離心濃縮儀。