納米遞送系統研究：凍干技術如何讓mRNA彈射起步？

6月15日，比爾?蓋茨在京訪問 GHDDI，并發表題為“以創新之力，應對全球挑戰"的主旨演講，并表示：“mRNA 疫苗技術使預防結核病和瘧疾等疾病的疫苗成為可能。"mRNA疫苗的發展也得益于凍干技術這一領域的突破性應用。
疫苗可以說仍是mRNA賽道上目前最主要的一大研發方向，而在此之外，逐漸成熟的mRNA技術也被應用于其他藥物領域，包括細胞與基因治療、抗體藥物、蛋白替代療法等，

具體如下：

mRNA技術核心離不開納米顆粒
預防傳染性疾病絕不是mRNA的全部使命，用mRNA技術攻克腫瘤才是接下來的主戰場。mRNA技術正在向各個領域滲透，帶來新的變革。作為mRNA技術核心的藥物遞送系統繞不開納米顆粒。
美國國家科學技術委員會(NSTC)早在2000年啟動了國家納米技術計劃(NNI)，并為該領域提出了明確的計劃和重大挑戰，納米顆粒(nanoparticles)占據了該計劃的很大一部分。納米顆粒可以提高被封裝貨物的穩定性和溶解度，促進跨膜運輸，延長循環時間，從而提高安全性和有效性。由于這些原因，納米顆粒的研究已經被廣泛應用在癌癥醫學、免疫治療和體內基因編輯中。

納米顆粒遞送mRNA用于蛋白質替代療法、基因組編輯和mRNA疫苗（參考資料1）[1]

納米顆粒極其多樣化，從固體脂質結構到脂質體，甚至是包含金/二氧化硅顆粒的設計。納米顆粒最近的作用之一是提供癌癥治療的藥物。它們的復雜的結構通常是基于核殼的，藥物被納米顆粒包裹并運輸到全身。這些藥物可以直接指向身體的特定區域，降低毒性，提高藥物的有效性。使用脂質納米顆粒 (LNPs) 包裹SARS- CoV-2 mRNA，作為最近開發的幾種COVID疫苗的基礎。
大多數納米顆粒配方都是在溶液中，尺寸分布不均。這些納米懸浮液可能是不穩定的，并受到沉降、團聚、晶體生長或化學反應等問題的影響。凍干可以增加這些顆粒的穩定性，這也有利于在其中加入的藥品的穩定性。
美國康涅狄格大學Xiuling Lu博士對此曾進行了一場網絡研討會專題演講并描述了冷凍干燥納米顆粒的挑戰以及如何與Robin Bogner博士合作，她的團隊設計并評估了凍干LNPs的解決方案。這份凍干技術報告總結了網絡研討會。
我們還在下文為大家推薦了幾款國際大廠都在采用的進口凍干機設備，以供參考。

凍干的挑戰
冷凍干燥過程中存在許多挑戰，其中一些是由于冷凍過程中冰的形成，會導致顆粒聚集或納米顆粒的結構損傷。所得到的餅形態在循環開發過程中對特定的玻璃化轉變和塌陷溫度(分別為Tg’和Tc)也很敏感。即使在凍干燥工藝優化后，也需要考慮重構時間，方便最終用戶給藥。
通過評估和優化這些參數以及使用凍干保護劑，可以改善每種納米顆粒和藥物的凍干條件。理想情況下，最佳的凍干產品將表現出優雅的餅狀形態，不會坍塌，保持納米顆粒的結構和藥物包封，含有低水分 (<2%) 可以長期穩定，并在短時間內重構。
Lu博士研究了三種不同納米顆粒的冷凍干燥條件：
· 固體脂質納米顆粒(SLNs)
· 聚合物納米顆粒(PNs)
· 脂質體(Lipos)
在研究配方和冷凍條件對納米顆粒質量的影響以及最終產品的長期穩定性之前，用一系列凍干保護劑測定了三種納米顆粒的Tg’和Tc。

這些實驗采用帶ControLyo® 技術的SP LyoStar3冷凍干燥機，使冰成核得到控制，所有小瓶同時凍冷成核。

配方的影響
比較了三種凍干保護劑對凍干納米顆粒 (SLNs、PNs和Lipos) 的保存效果：
1. 蔗糖 (1：5和1：10)
2. 海藻糖 (1：5和1：10)
3. 甘露醇 (1：5和1：10)
添加任何一種保護劑都沒有導致蛋糕形態的顯著變化， 在任何小瓶中都沒有產生合理的蛋糕。然而，有證據表明在一些小瓶中會收縮，特別是沒有凍干保護劑的脂質體。
雖然凍干蛋糕的優雅性相似，但通過添加凍干保護劑，大大減少了重構時間。在PNs中，甘露醇 (1：5和1：10) 將這次時間從35分鐘減少到5 min以下 (圖1)


圖1：添加凍干保護劑對重構時間的影響

我們還通過測量冷凍干燥前后的顆粒大小和均勻性 (多分散性指數，PDI) 來評估納米顆粒的成功凍干。凍干保護劑能保持SLNs和Lipos的顆粒大小，其中蔗糖和海藻糖比甘露醇更有效。在PNs中，添加或不添加凍干保護劑對顆粒大小影響不大。PNs配方中存在的PVA可能提供一定的聚集保護。蔗糖和海藻糖是保持顆粒大小和改善粒徑分布強有效的凍干保護劑。SLNs和Lipos需要凍干保護劑來維持尺寸分布，而PNs需要凍干保護劑來縮短重構時間。

凍結條件的影響
冷凍是凍干過程中的一個關鍵步驟。由于不受控制的凍結 ，可能會出現許多問題，如批次內冰晶大小的不均勻性， 以及由微小冰晶造成的更高的塌陷風險。
ControLyo® 是一種控制成核的技術，實現更高的成核溫度，產生更大的晶體，從而加快初級干燥時間。
在本研究中，我們比較了不同冷凍條件對每種納米顆粒的影響。
1. 無控制的冰成核：冷卻速率為1℃/min至-40℃；
2. 快速凍結：將顆粒浸入液氮中，然后放入冷凍干燥機進行干燥；
3. 慢速凍結：使用ControLyo®在-4℃，冷卻速度0.2℃/ min至-40℃；
4. 控制成核：使用ControLyo®在-4℃和-8℃控制冰成核，冷卻速率為1℃/min至-40℃。
在快速凍結條件下，所有產品均出現極嚴重的裂紋，不含凍干保護劑的 Lipos均發生塌陷。不受控制的冰成核也產生了顯著的蛋糕收縮。慢速冷凍是一種能同時增加含凍干保護劑的SLNs 和 Lipos 的粒徑和均勻性(PDI)的冷凍條件(圖2)。然而，慢速冷凍并不會影響PNs的粒徑或粒徑分布，可能是由于PVA的存在，如前所述。


圖2：冷凍條件的影響：結果—固體脂質納米顆粒

冷凍條件也不影響所有納米顆粒的重構時間和剩余水分含量，盡管添加有效的冷凍保護劑降低了所有納米顆粒的這兩個參數。
無菌潔凈室的冰成核溫度一般較低，因為控制的環境符合ISO 5或A分類。

長期穩定性
比較了不同的儲存條件，以確定納米顆粒的長期穩定性。
1．液體配方在室溫 (RT)
2．液體配方在4℃
3．未控制冰成核的凍干產品在室溫(RT)
4．控制冰成核的凍干產品在室溫(RT)
在室溫（RT）下以液體形式儲存SLNs，在10天內顯著增大了100%的粒徑(圖3)，并迅速提高了PDI。在4℃的冰箱中儲存SLNs稍微好一些，三個月時觀察到顆粒大小增加了100%。通過冷凍干燥，該納米顆粒的儲存得到了顯著改善。而當使用Controlyo控制成核方法時，3個月后顆粒尺寸沒有變化。目前還沒有Lipos的數據。


圖3：不同冷凍干燥和儲存條件下SLNs的平均粒徑變化

相比之下，PNs的大小和均勻性不受任何存儲條件的顯著影響，因為它們在所有條件下都相對穩定。

總結
在-4℃或-8℃下控制冰成核的冷凍干燥納米顆粒可以提供更好的餅形態而不塌陷，凍干保護劑能夠保存顆粒大小，改善顆粒均勻性，并縮短重建時間。然而，這些條件在不同的納米顆粒之間是不同的，所以單獨優化每個產品是很重要的，而不是假設條件是可互換的。
由于冷凍干燥產品的主要原因是增加長期穩定性和解決冷鏈運輸的難題，因此仔細評估每個納米顆粒的凍干條件最終將有利于許多藥物和疫苗產品的生產和儲存能力。

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