共聚焦顯微鏡用于光學切片比較厚的樣本。直接的問題是：1. 什么是“比較厚的樣本”；2. 光學切片到底有多厚？這兩個問題在一定程度上是相關的，即假設一份厚樣本至少比光學切片厚10倍。
生物樣本的厚度可以從10米（整只動物）到10納米（電子顯微鏡的超薄切片制備）。由于共聚焦顯微鏡采用了入射光的方法，樣本本身的尺寸可能有幾厘米或更多，但表面下方的穿透深度取決于材料的不透明度和物鏡的工作距離。這就限制了樣本大小（z方向），只能考慮使用厚度多為幾毫米的樣本。
光學切片的決定因素是衍射極限。根據各種不同的參數，共聚焦掃描顯微鏡的真正光學截面厚度可達到約0.5毫米。標準共聚焦應用（如組織切片）當中常用的樣本厚度為50 µm以內。
3D點擴散函數（PSF）和半高寬（FWHM）
圖1：z方向上強度分布的半高寬（FWHM）用作光學切片性能的衡量指標之一
點擴散函數通過足夠小的熒光小球生成，通過收集xz剖面圖的強度來加以記錄。上圖顯示了衍射圖中心的強度分布（紅色），并對50%數值之間的z方向距離進行測量（介于綠色線段之間）。
由光學系統產生的點（光斑）的圖像稱為“點擴散函數”（PSF）。點擴散函數描述了來自極小光斑的光在三維空間中的分布。這個衍射模型的中心是一個橢球形，影響著光學分辨率。徑向尺寸決定橫向分辨率，軸向尺寸決定聚焦深度，進而決定切片性能。
對于共聚焦截面切片，其目的在于只傳輸PSF的內核部分，即所謂的光學切片。實際上，針孔直徑可控制從內核外傳遞的光量。因此，處在衍射模型大小范圍內的光學切片很明顯不會出現類似于面包片的鋒利邊緣，但仍然存在著同等扁平斜率的特征。連接強度曲線兩側50%強度的z距離稱為“半高寬”（FWHM），而按照慣例，用于測量光學切片的厚度。光學切片的性能通常要通過聚焦在鏡面上來進行測量，鏡面用于模擬z方向上無限薄的結構。這種方法相對較容易實現并且可用于檢查共聚焦顯微鏡系統的性能。從更為現實的角度進行考慮，z切片性能還可以通過熒光小球進行測量（見圖1）。熒光小球能夠在符合現實中熒光成像非相干條件下進行性能測量，因此滿足了生物醫學科學中的大多數共聚焦應用。反射光模式（鏡面）中受衍射限制的光學切片與熒光模式的切片相比要薄得多。在比較文獻中的圖表時請務必牢記這一點。
控制光學切片厚度的參數
在理想條件下，可實現的切片厚度僅取決于光學衍射的限制。
影響大的是波長，主要按比例控制PSF的大小：波長越短，切片越薄。我們可以假設激發光的波長有限（而不是發射光的波長），因為照明區域外并無發射光。
第二個參數是物鏡的光圈（數值孔徑，NA）：NA越高（信息收集的角度越寬），則光學切片越薄。此外，樣本的折射率會影響軸向分辨率，進而影響到切片性能。圖2給出了切片尺寸與這些參數的相互關系。
第三個參數是探測路徑中的針孔直徑，對于上面給出的公式可假設其為零。因此，該公式給出了熒光成像的值，當然這只具有理論意義：直徑為零的針孔不會生成明亮的圖像！
圖2：熒光樣本中光學切片受衍射限制的小厚度。針孔直徑假設為零。真正共聚焦掃描系統中的半高寬（FWHM）。
光學切片厚度的評估關鍵
數值孔徑NA對切片厚度有顯著影響。PSF的徑向擴展與NA成線性關系。因此，對于低NA物鏡，PSF內核會拉得極長，而且切片會變得很厚。因此，絕大多數應用中都是用NA>1的浸潤式物鏡，其中xy和z維度的比例大致接近于2倍。按照經驗，高NA物鏡z部分分辨率大致為xy的兩倍。
理論上的考慮有助于評估光學系統的性能。實際上，儀器和樣本都會導致計算數值的偏差。必須仔細校準并操作儀器才能獲得性能。而樣本本身就是分辨率的敵人，尤其是在更深層次成像時。
因此，必須特別注意折射率匹配、適宜和恒定的溫度以及正確的蓋玻片選擇。該理論給出的是經驗法則，但樣本和設置可能會帶來顯著的偏差——因為生物樣本比晶體（或真空）更復雜，所以偏差通常也不可避免。
參考文獻
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