自21世紀(jì)初，隨著干細(xì)胞研究和組織工程的重大突破，類器官及其在顯微成像中的應(yīng)用取得了顯著進(jìn)展。已開發(fā)的多種類器官模型，如大腦、肝臟和腸道類器官，為研究器官發(fā)育、疾病機(jī)制揭示及治療評估提供了新途徑。同時，類器官成像技術(shù)的發(fā)展極大地促進(jìn)了研究人員對這些復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)以細(xì)節(jié)和動態(tài)模式進(jìn)行觀察的能力。盡管如此，類器官研究仍面臨多個挑戰(zhàn)，包括維持樣本活性、確保成像深度與分辨率，及處理和分析大量數(shù)據(jù)的需求。[1][2]
視頻1.肺腺癌類器官樣本，共聚焦四色成像，40x 甘油鏡，拍攝厚度71微米（144層），樣本來源伯楨生物bioGenous
DAPI-細(xì)胞核，CK7-細(xì)胞質(zhì)，F-ACTIN-細(xì)胞膜，TTF1-細(xì)胞核（強(qiáng)增值性細(xì)胞）
共聚焦顯微鏡物鏡的發(fā)展，特別是用于觀察厚樣本的物鏡，對匹配樣本和周圍介質(zhì)的折射率至關(guān)重要，否則會影響成像深度。高數(shù)值孔徑的油浸物鏡雖然提供高分辨率，但當(dāng)用于水樣本時由于折射率不匹配而面臨限制，導(dǎo)致球面像差。這影響了能夠有效成像的樣本深度，并降低了圖像質(zhì)量。
圖1.折射率
為了解決這些挑戰(zhàn)，研究人員開始使用甘油作為一種折射率接近生物樣本的介質(zhì)，將樣本置于甘油中，并使用甘油物鏡進(jìn)行成像。隨著技術(shù)的進(jìn)步，甘油物鏡的設(shè)計和性能不斷改進(jìn)，成為現(xiàn)代顯微鏡中常見的物鏡類型之一。
表1. 常見封片劑類型及其介質(zhì)折射率的表格
封片劑類型 | 介質(zhì)折射率 | 應(yīng)用 |
水基封片劑 | 約1.33 | 水溶性樣本，如染色后的細(xì)胞和組織切片 |
硅油 | 約1.40-1.41 | 活細(xì)胞成像和深度成像 |
VECTASHIELD®, ProLong®/ProLong® Gold | 約1.44-1.46 | 抗淬滅封片劑，長時間保持熒光穩(wěn)定性和減少光淬滅影響 |
Fluoromount-GTM | 約1.45-1.47 | 常用的yongjiu性封片劑 |
Mowiol® 或PVA | 約1.41-1.49 | 用于熒光標(biāo)記樣本，提供良好的折射率匹配和穩(wěn)定性 |
BABB, FocusClear, DBE | 約1.45-1.56 | 用于透明化樣本的成像 |
如今，大多數(shù)固定樣本都使用基于甘油的Mowiol、Vectashield或類似混合物進(jìn)行封片。這些介質(zhì)的折射率接近80/20甘油/水混合物的折射率（ne=1.45）。甘油物鏡（介質(zhì)折射率1.46）是在這種介質(zhì)中封裝的樣本的更佳選擇。
由于折射率匹配，甘油物鏡減少了散射和光損失，在廣泛的波長范圍內(nèi)都具有較好的透明度，提高了圖像質(zhì)量和信號強(qiáng)度，因此可實現(xiàn)更深的成像深度（見圖3）。
圖2. 甘油物鏡與水鏡成像效果對比（深度：200微米），樣本來源伯楨生物bioGenous
配合校正環(huán)，我們還可以調(diào)整光學(xué)系統(tǒng)以適應(yīng)封裝介質(zhì)的折射率變化，或者由于蓋玻片厚度或溫度變化引起的折射率變化。
在本期中，我們深入了解了類器官成像領(lǐng)域，共聚焦顯微鏡物鏡的創(chuàng)新及其在觀測厚樣本中的重要應(yīng)用。我們還探討了如何通過選擇與樣本折射率相匹配的浸沒介質(zhì)來解決成像挑戰(zhàn)。甘油物鏡的應(yīng)用充分證明了技術(shù)發(fā)展如何促進(jìn)了成像質(zhì)量和深度的提升，開辟了研究的新視野。
第二期我們將進(jìn)一步探索類器官研究中的綜合成像解決方案，涵蓋自動化樣本定位、高倍率成像的自動轉(zhuǎn)換、三維結(jié)構(gòu)的高分辨率成像，以及如何借助AI圖像分析軟件挖掘圖像中的深層信息。
我們邀請您繼續(xù)與我們同行，深入顯微成像技術(shù)的新領(lǐng)域，共同揭開細(xì)胞與生物分子研究的新奧秘。敬請期待我們的下一期內(nèi)容，將為您帶來更多精彩洞見。
圖3. 肺腺癌類器官樣本，共聚焦成像，40x 甘油鏡，DAPI-細(xì)胞核，F-ACTIN-細(xì)胞膜，樣本來源伯楨生物bioGenous
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