小鼠ELISA試劑盒說明書

  檢測范圍：31.2 pg/ml - 2000 pg/ml

zui低檢測限：7.8 pg/ml
特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的小鼠TNF-α，且與其他相關蛋白無交叉反應。

有效期：6 個月
預期應用：ELISA 法定量測定小鼠血清、血漿、細胞培養上清或其它相關生物液體中TNF-α
含量。
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
4．剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任
何影響。
概述
小鼠ELISA試劑盒 是一種具有多種生物活性的細胞因子。兔子TNF-α
基因編碼前體蛋白，其信號肽將前體蛋白固定在細胞膜上，成為具有活性的跨膜干擾素
（TNF），分子質量為26×103，經酶切去除信號肽生成分泌型TNF-α，分子質量為17×103。
TNF-α細胞來源廣泛，包括各種免疫細胞、內皮細胞、成纖維細胞、表皮細胞、角質細胞、
平滑肌細胞、星形細胞、成骨細胞等。
TNF-α具有廣泛的生物學活性，如：參與炎性反應和免疫應答，抗腫瘤，參與內毒素性休
克等病理過程，引起惡病質等。其具有雙重作用，,一方面在機體免疫調節，機體生理功能
和抗感染等方面發揮重要作用，另一方面若持續釋放或產生過多則會引起發熱!、休克、惡
病質等，同時TNF-α可進一步誘導IL-6、IL-8、IL-10 等細胞因子的產生，這些促炎性細胞
因子參與體內急性反應、發熱反應、引起趨化肽釋放等，還可使內皮細胞活化而導致血管通
透性增加。
實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗TNF-α抗體的微孔中依次加入標本或標
準品、生物素化的抗TNF-α抗體、HRP 標記的親和素，經過*洗滌后用底物TMB 顯色。
TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的。顏色的深淺
和樣品中的TNF-α呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃
度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯板（Assay plate ）：一塊（96 孔）。
2. 標準品（Standard）：2 瓶（凍干品）。
3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。
4. 生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液（HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6. 生物素標記抗體（Biotin-antibody）：1×120ul/瓶（1：100）
7. 辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：1×120ul/瓶（1：100）
8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。
10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標準規格酶標儀
2. 高速離心機
3. 電熱恒溫培養箱
4. 干凈的試管和Eppendof 管
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5. 系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6. 蒸餾水，容量瓶等
標本的采集及保存
1. 血清：全血標本請于室溫放置2 小時或4℃后于1000 x g 離心20 分鐘，取上清即可
檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2. 血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后30 分鐘內于2 - 8° C 1000 x g 離心15
分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3. 細胞培養物上清或其它生物標本：請1000 x g 離心20 分鐘，取上清即可檢測，或將標本
放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
標本的稀釋原則：
小鼠ELISA試劑盒  首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。只有稀釋至標準
曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。zui后計算濃度
時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。
標準品的稀釋原則：2 瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10 分鐘以上，
然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為2000 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋2000
pg/ml，1000 pg/ml，500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，樣品稀釋液
直接作為標準濃度0 pg/ml，臨用前15 分鐘內配制。
如配制1000 pg/ml 標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）2000 pg/ml 的上述標準品加入含0.5ml
樣品稀釋液的Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
生物素標記抗體的稀釋原則：
臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制
（每孔100ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10ul 生物素標記抗體加990ul 生物素標
記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。
辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：
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臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的
總量配制（每孔100ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10ul 辣根過氧化物酶標記親和
素加990ul 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內
配制。
操作步驟
實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。
每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試
劑盒的檢測范圍。
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標
準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，
輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120 分鐘。
為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液100ul（取1ul 生物素標記抗
體加99ul 生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制），37℃,60
分鐘。
3. 溫育60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分鐘，350ul/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100ul，37℃，60
分鐘。
5. 溫育60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分鐘，350ul/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30 分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4 孔
有明顯的梯度藍色，后3-4 孔梯度不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時藍色立轉）。終止液的加入順序應盡量與
底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
8. 用酶聯儀在450nm 波長依序測量各孔的光密度（OD 值）。在加終止液后15 分鐘以內進
行檢測。

注：
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。
測量時先用此孔調OD 值至零。
3. 為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、生物素標記抗體工作液、辣根過
氧化物酶標記親和素工作液請依據所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、生
物素標記抗體工作液或、辣根過氧化物酶標記親和素工作液。
5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，
酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml 注入孔內，浸泡1-2 分鐘。根據需
要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD 值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上
繪出標準曲線，根據樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準
物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出
樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
小鼠ELISA試劑盒 注意事項
1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控制在5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
5. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數。
北京方程生物
6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。
7. 底物請避光保存。
8. 不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。