人—山羊異質胚胎構建及胚胎干細胞的分離培養

人胚胎干細胞（hESCs）有分化為機體各種細胞的潛能,是再生醫學、藥物篩選及發育研究的一個重要來源。hESCs是從人胚胎細胞分離培養而來的,然而,人胚胎來源不足嚴重限制了hESCs的研究。以動物卵母細胞為受體、人體細胞為供體細胞的異質核移植技術為hESCs的研究提供了新的途徑,本文嘗試了用山羊卵母細胞為受體、人包皮成纖維細胞（HFFs）為供體構建人-山羊異質核移植（human-goat interspecies nuclear transfer, hgiNT）胚胎,并分離hESCs,旨在優化hgiNT方案,并為建立hESCs系提供技術幫助。研究內容如下: 1.為了選擇遺傳均一的供體細胞用于核移植,本實驗分別用條件培養液或用飼養層共培養對HFFs進行克隆分離和擴大培養,對照組在無飼養層的新鮮培養液中培養,Giemsa染色分析克隆細胞核型。結果:共培養組克隆存活率（31.43 %）顯著高于對照組（5.56 %）（P<0.05）,與條件培養液組相近（27.27 %,P>0.05）;飼養層共培養組擴大培養率（11.43 %）顯著高于對照組（0 %）（P<0.05）。7個細胞克隆中5個表現為正常核型（2n=44+XY）。結果表明,兩種方法均能提高HFFs形成克隆的比例,且能保持細胞染色體核型正常,用于核移植前供體細胞的篩選。 2.為了探索hgiNT條件,本實驗首先對電融合參數進行了摸索,進而測試了融合與激活間隔時間對重組胚胎體外發育的影響,zui后對比了mSOFaa和G1/G2序貫培養法對重組胚胎體外發育的影響。結果*的融合電壓、脈沖時程和脈沖次數分別為36 V、20μs和2次,*的融合與激活間隔時間為4 h,G1/G2序貫培養法的卵裂率和囊胚率均顯著高于mSOFaa培養法（71.81 % vs. 64.78 %,9.73 % vs. 4.76 %;P<0.05）。結果表明:hgiNT的電融合參數及融合與激活間隔時間與受體卵母細胞供應方（山羊）體細胞核移植相似,而核移植胚胎的培養條件傾向于供體細胞供應方（人）的胚胎培養條件。 3.本研究探討了TSA對供體細胞或重構胚處理對hgiNT胚胎發育的影響。選擇經5、25、50、75、100 nM TSA處理24 h的山羊胎兒成纖維細胞作為供體細胞進行核移植,結果在50、75 nM組,囊胚率有所增高（9.91 %、12.10 % vs. 8.47 %,P>0.05）;用5,25,50,75或100 nM TSA處理重構胚10 h,結果5、25、50、75 nM組的囊胚率均有所提高,其中25 nM組顯著高于對照組（16.41 % vs. 7.63 %,P<0.05）。TSA處理供體細胞和重構胚均能顯著提高克隆胚囊率,說明低甲基化的供體細胞有利于卵母細胞的重編程,推測TSA可能降低了核移植后供體細胞組蛋白去乙酰化水平,因而提高了克隆胚的發育率。 4.本實驗（1）用10 mg/L的絲裂霉素-C分別處理HFFs、MEFCs和GEFCs飼養層1.5 h、2 h、2.5 h、3 h,冷凍-復蘇后培養12 h,統計復蘇率,選擇合適的處理時間;（2）用HFFs、MEFCs和GEFCs作飼養層,接種ICM,比較它們對hESCs的支持情況;（3）在不同密度的HFFs飼養層上,接種相同的ICM數,統計hESCs的貼壁率、克隆形成率、分化率,從中選擇合適的飼養層密度。結果顯示:（1）以10 mg/L絲裂霉素-C*處理時間為2 h;（2）HFFs和MEFCs飼養層均能有效地支持hESCs增殖和保持未分化狀態;（3）HFFs飼養層的*密度是3×104/mL。 五、為了克服培養體系中異源性成份污染hESCs臨床應用的限制,本實驗采用無動物源性成份確定的HESCO體系對hgiNT胚胎來源的hESCs（iNT-hESCs）進行體外培養（HESCO組）,以HFFs為飼養層的常規培養體系為對照組（HFF組）,觀察iNT-hESCs在兩種培養體系中的生長狀況,探討HESCO體系對iNT-hESCs生長的支持情況。結果,HESCO組的iNT-hESCs有與HFF組相似的細胞形態、增殖速度、堿性磷酸酶活性和遺傳穩定性;結果表明HESCO培養體系能支持iNT-hESCs的生長并能保持其未分化狀態,這對iNT-hESCs用于臨床治療且有重要意義。