瓊脂糖的原理及實驗過程

實驗原理

瓊脂糖凝膠電泳常用于分離、鑒定 DNA、RNA 分子混合物，以瓊脂凝膠作為支持物，利用 DNA 分子在電場中時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。DNA 分子在高于其等電點的溶液中帶負電，在電場中由陰極向陽極運動。在一定的電場強度下，忽略DNA分子攜帶的電荷，DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA 分子的遷移速度與相對分子量成反比。

不同構型的 DNA 分子的遷移速度不同。如環形 DNA 分子樣品，其中有三種構型的分子：超螺旋分子（cccDNA）、開環分子(ocDNA)、和線形 DNA 分子(IDNA)。這三種不同構型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為:cccDNA＞IDNA＞ocDNA。

核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質。瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子；聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺（Acr）在 N,N,N′-四甲基乙二/胺（TEMED）和過/硫酸/銨（AP）的催化下聚合形成長鏈，并通過交聯劑 N,N′-亞甲雙丙烯酰胺（Bis）交叉連接而成。瓊脂糖凝膠適合分離200bp至近50kb的DNA片段，而聚丙烯酰胺凝膠對于小片段（5bp-500bp）的分離效果很好，且分辨力好。選擇不同濃度的凝膠，可以分離不同大小范圍的 DNA 分子。電場強度愈大，帶電顆粒的運動赹快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小，所以電泳時一般采用低電壓，不超過 6V/cm。而對于大片段電泳，可以選擇 0.5-1.0V/cm 電泳過夜。如果選擇高電壓電泳，可使用聚丙烯酰胺凝膠。

核酸電泳常采用 TAE、TBE、TPE 三種緩沖系統。TAE 價格低廉，但緩沖能力低。TPE 在進行 DNA 回收時，會使 DNA 污染磷酸鹽，影響后續反應。所以綜合考慮，多采用 TBE 緩沖液。

核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠（EB）。溴化乙錠是一種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線照射 BE-DNA 復合物時，通過發光指示核酸的位置。由于EB有較強的揮發性和毒性，現在大多選擇EB替代品進行試驗，比較常用的有gelred，goldview，ybr-green等，但是整體效果都弱于傳統的EB。

材料、試劑及器具

1、材料
合適的Marker（分子量標準）；DNA 樣品
2、試劑
加樣緩沖液（6x或10x）；瓊脂糖；溴化乙錠（EB）。
3、器具
（1）電泳系統：電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。
（2）凝膠成像系統或紫外透射儀。

實驗過程

1、按所分離的 DNA 分子的大小范圍，選擇合適的比例的凝膠，稱取適量的瓊脂粉，放到一錐形瓶中，加入適量的 TBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至瓊脂粉溶化，溶液透明。稍搖勻，得膠液。待膠液卻至 60℃左右，在膠液內加入適量的比例的溴化乙錠液。
2、水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內緩慢倒入已況至 60℃左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。
3、待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進電泳槽內。
4、在槽內加入TBE電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面。
5、把待檢樣品，按合適比例與加樣緩沖液混勻，用移液槍加至凝膠的加樣孔中。
6、接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調節合適電壓，穩壓輸出，開始電泳。
7、觀察溴酚蘭的帶（藍色）的位置。當其移動至約凝膠長2/3處時，可停止電泳。
8、在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把凝膠放在上面。關上樣品室外門，打開紫外燈（360nm 或 254nm），通過觀察孔進行觀察。