木瓜蛋白酶的性質及酶活測定方法

木瓜蛋白酶（Papain），又稱木瓜酶，是一種蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜（Carieapapaya）中含有的一種低特異性蛋白水解酶，廣泛地存在于番木瓜的根、莖、葉和果實內，其中在未成熟的乳汁中含量。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，屬于巰基蛋白酶，它具有酶活高、熱穩定性好、天然衛生安全等特點。

化學性質
木瓜蛋白酶是一種在酸性、中性、堿性環境下均能分解蛋白質的蛋白酶。它的外觀為白色至淺黃色的粉末，微有吸濕性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液為無色或淡黃色，有時呈乳白色；幾乎不溶于乙醇、氯/仿等有機溶劑。木瓜蛋白酶是一種含巰基(-SH)肽鏈內切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對動植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強的水解能力，但幾乎不能分解蛋白胨。
木瓜蛋白酶的PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性時亦有作用，等電點（pI）為8.75；木瓜蛋白酶溫度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐熱性強，在90℃時也不會失活；受氧化劑抑制，還原性物質激活。

催化機制
木瓜蛋白酶的剪切肽鍵的機制包括：在His-159作用下Cys-25去質子化，而Asn-158能夠幫助His-159的咪唑環的擺放，使得去質子化可以發生；然后Cys-25親核攻擊肽主鏈上的羰基碳，并與之共價連接形成酰基－酶中間體；接著酶與一個水分子作用，發生去酰基化，并釋放肽鏈的羰基末端。

酶活測定
基本原理
木瓜蛋白酶能使N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（底物）水解而釋出N-苯甲酰-L-精氨酸，其釋出量可用氫氧化/鈉液滴定，以此確定酶活力。

酶活單位
在25℃下，每分鐘內能催化分解1umol底物的酶量，稱為1單位。

試液制備
1、底物溶液：準確稱取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽1.42g，加10mmol/LEDTA、50mmol/L半胱氨酸液2.6mL，加適量水，用0.1mol/L氫氧化/鈉液調節pH至6.2，最后定容至50.0mL。
2、待測酶液：取試樣用水稀釋至適當濃度，并調節至pH6.2。

測定方法
25℃恒溫條件下，取25mL燒杯裝在pH自動滴定儀上，加底物溶液3.75mL、3mol/L氯化鈉溶液2.50mL、重蒸餾水1.25mL，混合后加入待測酶液后立即計時，用0.1mol/L氫氧化/鈉在電磁攪拌下連續滴定以保持pH6.2，記下每分鐘所耗0.01mol/L氫氧化/鈉毫升數。同時進行空白校正。按下式計算木瓜蛋白酶的活力P（單位/mg）：
P =C·ΔV·1000/W
式中：c：氫氧化/鈉液的濃度，mol/L；ΔV：每分鐘消耗氫氧化/鈉液的體積減去空白值；W：反應液中木瓜蛋白酶的質量，mg。