（二）步驟：先將抗原（或抗體）用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔內加0.1ml，4℃過夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600（根據據抗體的滴度而定），分別加入反應孔中，每個稀釋度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘。以2M H２SO4 0.05ml終止反應。
（三） 結果判定：主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值，并以OD為縱座標，結合物濃度為橫座標，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率zui大時的酶標抗體稀釋度，即為該標記物的工作濃度。
注意事項
1. 在具備高質量HRP的條件下，所要標記的抗體也要活性高、效價高（zui低1:16）、純度高、親和力好，這是保證標記物效價高，免疫活性好的首要條件。
2. 所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴格掌握。所用試劑，（或必需）新鮮配制。如在戊二醛標記法中所用戊二醛應為新鮮純品，因戊二醛儲存過久可形成縮和體（雜質）。否則，影響標記效果。
3. 室溫攪拌時須避光，室內溫度一般在25℃為宜。標記物每次透析前，須認真檢查，防止漏液。
4. 濃的標記物相當穩定，常加入30-40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1-2年，但稀釋成1:10，只能保存數周。已配制的使用液應在12小時內用完。切忌反復凍融。
