細(xì)胞實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、細(xì)胞復(fù)蘇 將細(xì)胞凍存管從干冰中取出，立即放置37°水浴速融1min，見無冰晶即可不再水浴（用鑷子拿取） 將細(xì)胞凍存液加入10~15ml完培中，吹打混勻，減少DMSO對細(xì)胞毒性，800rpm離心5min 棄上清，細(xì)胞沉淀進(jìn)行下一步傳代。 

2、細(xì)胞傳代 試劑與材料（貼壁細(xì)胞）： 細(xì)胞：4T1乳腺癌細(xì)胞；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1640培養(yǎng)基（含有生物素、 維生素 B12、對氨基苯甲酸PABA、高濃度的維生素肌醇和膽堿；不含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或生長因子）；血清：胎牛血清FBS（細(xì)胞營養(yǎng)液：提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、提供激素和各種生長因子、提供結(jié)合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷、對培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用）；胰酶（消化貼壁細(xì)胞促附著蛋白如層黏連蛋白、纖維連接蛋白等） 

實(shí)驗(yàn)方法： 

1）試劑解凍：胰酶，培養(yǎng)基在37°水浴加熱解凍 

2）制備培養(yǎng)基：1640培養(yǎng)基中加入10%的血清，水平搖勻，避免震搖引起泡沫 

3）細(xì)胞消化：將原來培養(yǎng)基倒除，用500μlpbs/胰酶先潤洗（消化培養(yǎng)基里的蛋白，避免對細(xì)胞生長產(chǎn)生影響），去除胰酶，再沿壁（不直接加到細(xì)胞表面）加入1ml胰酶，在37°中消化3~5min（可1min左右觀察消化情況）。 

4）細(xì)胞傳代：加入3ml完培，輕柔吹打，取1/4的消化后的細(xì)胞（其余的倒掉）加至EP管，在細(xì)胞離心機(jī)上離心1000rpm 5min，離心后的細(xì)胞，輕柔放置，防止細(xì)胞混散，可傾倒除去胰酶液（留一點(diǎn)點(diǎn)液體保持細(xì)胞活性）快速加入培養(yǎng)基。以10CM培養(yǎng)皿為例：先在皿中加入7ml的培養(yǎng)基。在EP管中懸空加入1~2ml左右培養(yǎng)基（60MM皿3ml培養(yǎng)基；10CM皿10ml培養(yǎng)基），輕柔的吹打，可以沿壁混合，使黏附細(xì)胞變成單細(xì)胞；將細(xì)胞液加入至皿中，劃10次8字使皿充分被浸潤，放置37°孵育。 

5）注意事項(xiàng)： 在進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前，需紫外照射生物柜30min，穿戴整齊后方可進(jìn)入細(xì)胞房。 胰酶和培養(yǎng)基需37°水浴加熱，至適合細(xì)胞生存溫度。 開始實(shí)驗(yàn)前，關(guān)閉紫外照射，打開風(fēng)櫥和燈光。 開始實(shí)驗(yàn)時，需要手消且所需物品需要消毒，才可放入生物柜中，臺面用酒精棉球消毒 物品擺放整齊，留出空間實(shí)驗(yàn)，右手用的在右手，左手用的在左手，切勿交叉。瓶蓋用前可擰松，開口朝上或立放。每用完槍頭盒，需蓋蓋，且切勿雙手經(jīng)過槍頭盒。實(shí)驗(yàn)室，槍桿不要伸入瓶中或管中。 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，所用試劑需標(biāo)簽；清理垃圾和廢液；帶走自己的東西；關(guān)閉燈光和通風(fēng)櫥。 下一次傳代前，顯微鏡中觀察細(xì)胞生長情況，密度70%~80%左右，即可傳代。 試劑與材料（懸浮細(xì)胞） thp-1（人急性白血病單核細(xì)胞）——顯微鏡觀察時，晃動皿，細(xì)胞游動；1640培養(yǎng)基，25培養(yǎng)瓶，10CM培養(yǎng)皿，45mlEP管 實(shí)驗(yàn)方法 轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿中的細(xì)胞至45mlEP管，移液槍吹打（沿壁吹打，使之變成單個細(xì)胞） 1000rpm，離心5min ，得到細(xì)胞沉淀 快速傾倒上清液（沿細(xì)胞堆積的另一邊），保留500μl左右的液體 細(xì)胞沉淀加入4ml培養(yǎng)基（反復(fù)吹打），培養(yǎng)皿中加入7ml培養(yǎng)基（共10ml），25培養(yǎng)瓶中加入4ml培養(yǎng)基（共5ml） 重懸后細(xì)胞液分別移至培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶中，輕微搖晃，放置37°恒溫箱