超濾離心管具體用法

超濾離心管是一種采用優(yōu)化過濾結(jié)構(gòu)的設(shè)計方式，減少濃差極化，降低了膜易污染堵塞機率，加快了離心速度，縮短了離心所需的時間；超濾離心管還可用的膜表面面積提供快速樣品處理。

超濾離心管具體用法：

(1)選擇合適的超濾管。通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3，認(rèn)真閱讀使用說明書，注意超濾膜對各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同。

(2)新買來的超濾是干燥的，使用前加入超純水，水量過膜，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn)。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預(yù)冷。

(3)平衡。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾(離心機預(yù)冷至4度)。不同離心機的轉(zhuǎn)速 rpm換算成g之后，有所不同。離心機的加速度調(diào)至低檔，減小對膜的壓力。注意，一定要等離心機達(dá)到目的轉(zhuǎn)速之后，方可離開離心機，否則離心機出問題時，無法第一時間處理。膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說明書調(diào)整(角轉(zhuǎn)離心機的情況是膜與軸垂直)。在實際使用中，一般轉(zhuǎn)速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。

(4)當(dāng)濃縮到剩下1ml時，取50ul緩沖溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍(lán)色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管，用5mgml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作，防止蛋白受熱)，直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀，導(dǎo)致堵管。若發(fā)生沉淀，要確定沉淀的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適;前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決，后者的方法是換不同的緩沖溶液，直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。

(5)前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer(經(jīng)0.22um超濾膜超濾)，再濃縮至1ml左右，連續(xù)三次，最后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定，一般不多于500ul，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達(dá)到1000倍以上，基本上可以達(dá)到換buffer的目的。