免疫組織化學工作流程

免疫組織化學工作流程

1 石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS（PH7.4）沖洗三次，每次5分鐘。
PBS配制 （2000ml）PH7.4
氯化鈉： 17g
磷酸二氫鈉：0.4g
磷酸氫二鈉：6.3g
2 根據每一種抗體的要求，對組織抗原進行相應的修復。我科采用壓力鍋進行抗原修復，取一定量的修復液于壓力鍋中，加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于不銹鋼或耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續加熱至噴氣，從噴氣開始計時，2分鐘后，壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫（也可以稍冷后，在自來水下加速冷卻）。取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩遍（用蠟在組織周圍劃圈，防止抗體跑散，但圈要大一點），之后用PBS（PH7.4）沖洗三遍。每次5分鐘。
檸檬酸緩沖液的配制（PH6.0）
0.1M檸檬酸：（4.2g+200ml蒸餾水）
0.1M檸檬酸三鈉 （14.7g+500ml蒸餾水）
取檸檬酸三鈉41ml+檸檬酸9ml加入450ml蒸餾水中，總量為500ml即可。
3  配制3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，孵育十分鐘。
PBS90 ml+30 %過氧化氫10 ml，現用現配并搖勻，蓋上蓋子，防止見氧分解揮發。
4  PBS沖洗三次，每次5分鐘。
5  滴加4 %羊血清封閉，室溫30分鐘，以減少非特異性染色。
PBS10 ml+正常羊血清400 ul
6  甩去羊血清，根據不同的項目配制并滴加不同的一抗，濃縮型的抗體一定要在購買后先用已知的陽性片做梯度實驗，根據結果情況找出*稀釋濃度再用到臨床診斷。工作液也應該在購買后先用已知的陽性片檢測抗體的染色效果，直接滴加即可。每次還應帶上陽性對照和陰性對照，以保證結果的可靠性。每張切片滴加足夠量的一抗并放入濕盒，防止切片干燥影響結果，室溫孵育2小時。
抗體稀釋液的配制 牛血清白蛋白：2mg
疊氮鈉： 10～20ml
雙蒸水： 10ml
7  PBS沖洗三次，每次5分鐘。
8  滴加二步法EnVision TM孵育30分鐘。
9  PBS沖洗三次，每次5分鐘。
10  甩去PBS液，每張切片滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，陽性信號為棕黃色或棕褐色。一般顯色時間為5分鐘左右，終止反應，自來水充分沖洗。
11  蘇木素復染，0.1%鹽酸酒精分化，氨水返蘭或自來水返蘭（自來水返蘭時間要稍長些，應該在顯微鏡下看以下蘇木素復染情況），自來水沖洗。
12  梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，閱片并總結染色結果。