去甲變腎上腺素ELISA Kit

時間：2011/8/31閱讀：1421

去甲變腎上腺素ELISA Kit

（德國IBL：RE59171）

前言說明

兒茶酚胺類腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺都是在腎上腺髓質、交感神經系統和腦中合成的。它們幾乎影響所有的組織，并與其它激素和神經系統一起參與各種生理過程的調節。因為兒茶酚胺類物質以及它們的代謝產物變腎上腺素和去甲變腎上腺素在許多疾病中的分泌都會增加，因此對它們進行檢測可用于這些疾病的診斷。在這一實驗中，診斷和神經系統的續發性腫瘤都具有特殊的重要性。這一技術主要用于嗜鉻細胞瘤、神經細胞瘤和神經節細胞瘤的診斷檢測。10%的嗜鉻細胞瘤表現為惡性增長。而在良性腫瘤中可發現兒茶酚胺類物質及它們的代謝產物變腎上腺素和去甲變腎上腺素都會增加。

1、應用范圍

此酶免試劑盒可用于人體尿液中去甲變腎上腺素的體外定量檢測,可手動操作也可自動操作.

2、實驗原理

此ELISA試劑盒利用的是競爭法原理，生物素標記抗原和未用生物素標記抗原競爭結合一定量的抗體結合位點。結合到抗體上生物素標記抗原的量與樣品中被分析物的濃度成反比。反應系統達到平衡后，未結合的生物素標記的抗原用洗滌液洗去。以抗生物素堿性磷酸酶作為標記物，以PNPP（對硝基苯酚磷酸鹽）作為底物液來檢測結合到抗體上的生物素抗原的量。將未知物的酶反應活性和已知標準品的反應曲線相比較，可以得到未知物的量。

3、意事項和預防措施

1）此試劑盒僅用于體外診斷和專業人士使用。

2）在檢測開始之前，仔細和完整的閱讀說明書，使用試劑盒提供的包裝插件的有效版本，確保所有的程序都清楚。尋求更多信息（比如：臨床背景，檢測操作，自動化操作說明，可選擇的軟件，文獻等等），請查看IBL公司主頁。

3）如果試劑盒有破壞的請與IBL公司或是提交你的申請，但自您拿到試劑盒后zui遲不超過一個星期。檢測時請不要使用已被損害的試劑，以確保自身安全。

4）按照批號和有效期，不混合使用不同批號的試劑，也不要使用過期的試劑。

5）遵守好的實驗準則和安全指南。穿實驗服，帶橡皮手套，有必要時請戴護目鏡。

6）此試劑盒中含有會傷害眼睛和皮膚的有害試劑。請閱讀材料來源和標簽獲取詳細信息。產品的材料安全數據單能夠從IBL公司主頁上下載，也可直接咨詢IBL公司獲取。

7）根據國家生物有害物質及安全條例，所有化學藥品和準備或使用過的試劑都應當做有害物質進行處理。

8）不要接觸終止液，以免造成皮膚損傷或著燒。

4、存與穩定性

試劑盒和運輸環境和儲存環境溫度為2-8℃，避免熱源或太陽直射。樣品的儲存與穩定性及試劑的準備將在相關章節中闡述。開封的試劑盒在有效期內穩定，前提是要將試劑盒用袋子密封并儲存于2-8℃的環境下。

5、樣品的采集與貯存

注意	人體內的兒茶酚氨和間甲腎上腺素的釋放會受到一些食品和藥物的影響。因此在樣品采集前72小時內病人應禁止服用下列食物和藥品：維生素B，咖啡，香蕉，α甲基多巴，MAO，COMT抑制劑，還有降血壓類藥物。

尿液

可以是自然尿液也可使用24h尿液。將病人24h內的所有尿液都收集到，并混合于含10-15ml 6N的HCl防腐劑的試劑瓶中。
貯存	≤-20℃	避免熱源或太陽直射，避免反復凍融，冷凍狀態下運輸樣品。
穩定性	6個月

6、試劑盒成分

注意	試劑盒有足夠做96份單孔檢測或48份雙孔檢測或間甲腎上腺素和去甲變腎上腺素共同檢測時所需的試劑成分

數量	標記	成分
1×50mL	ASSAYBUF CONC	檢測緩沖液，10倍濃縮，內含磷酸緩沖液，BSA（牛血清白蛋白），1%的NaN3
1×2.25mL	ACYLREAG	酰化試劑，即用，內含二甲基甲酰胺
1×10mL	INDICATIORBUF	指示劑緩沖液，紫色，即用，內含Tris緩沖液和苯酚紅（pH小于7.5時顏色會發生變化）。
2×50×	HYDRTUB	水解試管，可處理的聚苯乙烯試管
1×20mL	HCl	HCl，即用，內含0.1M HCl
1×12×8	MTP	包被板，可拆分，包被有抗兔IgG（羊，多克隆）
1×7×0.35mL	CAL A-G	標準品，A-G含去甲變腎上腺素和0.1M的HCl 0; 77; 192; 480; 1200; 3000; 7500μmol/L 0; 0.42; 1.05; 2.63; 6.56; 16.4; 41.0μmol/L
1×2×0.5mL	CONTROL 1+2	質控1+2，即用，濃度及允許范圍請見標簽
3×	BIOTIN LYO	去甲變腎上腺素生物素（凍干品），內含去變甲狀腺生物素, Tris緩沖液,<0.1%NaN3（可再生）
1×7m L	ANTISERUM	去甲變腎上腺素抗血清，內含含抗血清（兔）,磷酸緩沖液,0.1%NaN3
1×250μl	ENZCONJ CONC	酶聯物（100×），含抗生物素抗體,并聯結到堿性磷酸酶上,Tris緩沖液,0.01%NaN3
9×	PNPP SUBS	PNPP底物片，含PNPP
1×27mL	PNPP BUF	PNPP底物緩沖液，含二乙醇胺、水和0.05%NaN3
1×15mL	PNPP STOP	PNPP終止液，即用，內含1M的NaOH和0.25M的EDTA。
1×50mL	WASHBUF CONC	洗滌液（10×），含Tris緩沖液,HCL,吐溫,0.2%NaN3
3×	FOIL	粘性金屬板

7、實驗所需器材（但試劑盒不提供）

1）移液器，體積：10;50;100;1000ul

2）玻璃試管（12×75mm）

3）振蕩器（200-900rpm）

4）旋渦混合器

5）水浴箱，90℃

6）帶試劑儲器的8孔移液器

7）洗滌瓶，自動或半自動包被板洗滌系統。

8）可在405nm處讀數的酶標儀（參考波長：600-650nm）

9）雙蒸水或去離子水

10）吸水紙，取樣吸頭和計時器

8、注意事項

1）樣品的不合理處理及實驗操作的任何改動都將影響實驗結果。取樣體積、溫育時間、欲處理步驟都必須嚴格按說明進行。只能使用標準移液器和標準設備。

2）一旦實驗開始，所有的步驟都必須完整的進行下去，切勿中斷。確保所有試劑、材料和設備都已準備好。把所有試劑和樣品都平衡至18-25℃，在使用前，輕輕搖動液體試劑和樣品，試劑混合過程時要避免產生氣泡。

3）請勿接觸試劑、移液器、微孔/試管。加試劑和樣本時，請使用新的吸頭，以避免交叉污染。不用的試劑應用蓋子蓋好，以免重復使用。

4）我們建議對樣品進行雙份檢測，以便能糾正潛在的滴定錯誤

5）用定標儀對反應板進行校準。

6）溫育時間會影響實驗結果。微孔加樣的順序和時間都必須一致。建議使用8孔移液器加樣。

7）包被板的清洗很重要，清洗不合理將會導致錯誤的實驗結果。建議使用多孔移液器或自動包被板清洗系統進行清洗。溫育期間避免微孔干燥，清洗和吸液時不要碰到包被板微孔。清洗時，確保所有的微孔都充滿蒸餾水，并且無殘留物。

8）濕度會對包被孔產生影響，所以包被板未平衡到室溫時不要打開包裝。不使用的微孔應立即裝入含干燥劑的包裝袋中。

9、實驗前的準備說明

手動或自動操作參考說明

注意	這種96人份的試劑盒可分成3份獨立進行，以下體積為4條（32人份）一次檢測所需體積。如果想把標準品從7份減到6份，可以把標準品G棄取。而允許范圍相應的減少到3000μg/l。

如果檢測是用了很多板條，則體積應相應改變。

9.1凍干成分或濃縮成分的準備

特別注意	如果你使用甲狀腺ELISA試劑盒來同時檢測間甲腎上腺素和去甲變腎上腺素，請勿混合間甲腎上腺素和去甲變腎上腺素酶聯物。
稀釋/溶解	成分		稀釋	比例	備注	貯存	穩定性
15mL	檢測用緩沖液	150mL	雙蒸水	1:10		2-8°C	2周
15mL	洗滌液	150mL	雙蒸水	1:10		2-8°C	4周
1瓶	去甲變腎上腺素生物素	2mL	稀釋的檢測緩沖液		臨時配制,僅使用一次,靜置5min,混合時避免氣泡.	≤-20°C	2個月
60μl	酶聯物	6mL	稀釋的檢測緩沖液	1:101	臨時配制,僅使用一次	18-25°C	5小時
3	PNPP底物片	8mL	PNPP底物緩沖液		臨時配制,僅使用一次	18-25°C	5小時

9.2總去甲變腎上腺素檢測用的尿液樣品、標準品和質控品的水解（在水解試管中）

注意	水解這一步驟在總去甲變腎上腺素和總間甲腎上腺素的檢測中是*的。而在游離去甲變腎上腺素和變腎上腺素的檢測中則無須水解。樣品被懷疑高于zui高標準的樣品必須在水解步驟前用0.1M HCL進行稀釋。

9.2.1水解試管中樣品的準備

1）將標準品、質控品和尿液樣品各10μL加入到相應的水解試管中

2）在每一試管中加入40μL0.1M的HCl。

3）蓋好試管，90°C下水解1h（用溫度計測溫度）。之后平衡至室溫，旋渦混合。

4）在每一試管中加入100μL指示劑緩沖液，旋渦混合。

5）在每一試管中加入20μL的酰化作用試劑，加入指示劑后立即震蕩，確保加入的酰化試劑和試管內物質*混合。

6）蓋好試管，室溫下溫育15min。

7）在每一試管中加入1mL稀釋的檢測緩沖液。

10、實驗步驟

手動和自動操作

1）將酰化標準品、酰化質控品和酰化病人樣品分別50μL加入到相應的微孔中。

2）在每一微孔中加入50μL去甲變腎上腺素生物素。

3）在每一微孔中加入50μL去甲變腎上腺素抗血清。

4）蓋板，小心振蕩包被板。振蕩器（500rpm）上室溫溫育1h（500rpm）

5）移去粘性金屬板。棄取孔內反應液，每孔用250μL洗滌液洗板6次（洗板機洗）,（人工清洗則洗3次即可），吸水紙上拍干。

6）在每一微孔中加入150μL臨時配制的酶聯物。

7）蓋上一新的粘性金屬板。振蕩器（500rpm）上室溫（18-25℃）溫育30min。

8）移去粘性金屬板。棄取孔內反應液，每孔用250μL洗滌液洗板6次（洗板機洗）,（人工清洗則洗3次即可），吸水紙上拍干。

9）如果有條件的話，使用8孔微量移液器加底物液和終止液時。確保底物液和終止液都是相同的時間間隔加入。使用自動置換型移液器并避免氣泡產生。

10）在每一微孔中加入100μL臨時配制的PNPP底物液。

11）振蕩器（500rpm）上室溫（18-25℃）溫育20min。

12）在每一微孔中加入100μL PNPP終止液以終止底物反應，輕輕振板以混合溶液。

13）加入終止液后60min之內在405nm處測OD值（參考波長：60 0-650nm）

11、結果計算

在半對數坐標紙上或用自動的方法，以標準品的OD值為Y軸，濃度為X軸，繪制一條標準曲線。用立體圖、4參數對數圖或對數-對數圖都可獲得良好的實驗結果。對于標準曲線圖，用標準品的每一單值進行計算（樣品結果明顯異常的值必須刪除掉，應使用更加合理的單值）。樣品的濃度可直接從標準曲線上獲得。一旦樣品稀釋了，就應當乘以相應的稀釋因子。如果樣品所測得的濃度高于zui高標準，則應根據實驗前準備說明所述對樣品進行稀釋，并重新檢測。

計算每一尿液樣品的24小時的排泄量：μg/24h=μg/L×L/24h

轉換：1ng/mL=1μmol/L

去甲變腎上腺素（μg/L）×5.46×10^-3=μmol/L

12、期望值

實驗結果不能當作判斷任何治療結果的*因素，疾病的判斷還應當與其它臨床觀察和診斷檢測相結合。以下結果為正常人群的正常值（5%-95%）：

平均值：230ug/d 范圍：35-445ug/d（95%）

建議每個實驗室都確定自己實驗室的正常值范圍。

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。

中國*總代理：深圳市科潤達生物工程有限公司

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免費：

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