人粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF） ELISA試劑盒

時(shí)間：2011/11/9閱讀：1674

人粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF） ELISA試劑盒

日本IBL*，貨號(hào)：27131

日本IBL中國*代理商“深圳科潤達(dá)生物工程有限公司”竭誠為您服務(wù)

簡介

G-CSF屬于細(xì)胞因子類，刺激中性粒前體細(xì)胞的分化和增殖，它由成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，且有報(bào)道稱，在某些腫瘤內(nèi)可刺激其增殖。人G-CSF試劑盒可檢測人G-CSF

原理

此試劑盒根據(jù)酶免法的夾心原理，利用兩種不同的高特異性抗體，TMB作為著色劑，顏色強(qiáng)度與人G-CSF的量成正比

檢測范圍

7.81~500pg/ml（37℃下*次孵育1小時(shí)）

1.95~250pg/ml（4℃下*次孵育過夜）：內(nèi)部數(shù)據(jù)

預(yù)期用途

1. 此試劑盒用于細(xì)胞上清液中人G-CSF的定量檢測

2. 重組的和天然的G-CSF都可以用此試劑盒檢測

3. 經(jīng)驗(yàn)表明，由于全血的干擾，血清或EDTA血漿的稀釋比例較低可導(dǎo)致結(jié)果更低（見附錄一）

試劑盒組成

1. 包被板，96孔，包被有抗人G-CSF鼠IgG單抗，親和純化

2. 標(biāo)記抗體濃縮，30X，0.4mlx1，HRP標(biāo)記的抗人G-CSF兔IgG Fab’，親和純化

3. 標(biāo)準(zhǔn)品，1.0mlx2，重組人G-CSF

4. EIA緩沖液，30mlx1,1%BSA，含0.05%吐溫20的PBS

5. 標(biāo)記抗體稀釋液，12mlx1,1%BSA，含0.05%吐溫20的PBS

6. 著色劑，15mlx1，TMB底物液

7. 終止液，12mlx1，1N硫酸

8. 洗滌緩沖濃縮液，50mlx1, 40X，含0.05%吐溫20的磷酸緩沖液

實(shí)驗(yàn)所需材料但試劑盒未提供

1. 酶標(biāo)儀（450nm）

2. 移液器和槍頭

3. 燒杯

4. 蒸餾水

5. 孵箱（37±1℃）

6. 坐標(biāo)紙（對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)）

7. 吸水紙

8. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋管

9. 洗瓶

10. 一次性試驗(yàn)管

準(zhǔn)備

1. 洗滌緩沖液制備：先將洗滌濃縮液平衡至室溫，充分混勻，然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻，即得。配制的洗滌液應(yīng)保存于冰箱內(nèi)，并于2周內(nèi)用完

2. 標(biāo)記抗體的制備：用標(biāo)記抗體稀釋液將標(biāo)記抗體稀釋30倍，即得。

例：如果只測一條板，8孔，則需要標(biāo)記抗體800ul（30ul的標(biāo)記抗體+870ul的標(biāo)記抗體稀釋液，混勻，使用時(shí)每孔加100ul）

此步驟在實(shí)驗(yàn)前完成

剩余的標(biāo)記抗體濃縮應(yīng)裝于密封瓶內(nèi)，保存在4℃

3. 標(biāo)準(zhǔn)品的制備：吸取1.0ml的去離子水至標(biāo)準(zhǔn)品瓶內(nèi)，充分混勻，得到1000pg/ml的人G-CSF標(biāo)準(zhǔn)品

4. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：準(zhǔn)備8個(gè)試管用于標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋，每管加入230ul的EIA緩沖液

每管的濃度如下

1號(hào)管 500pg/ml

2號(hào)管 250pg/ml

3號(hào)管 125pg/ml

4號(hào)管 62.5pg/ml

5號(hào)管 31.25pg/ml

6號(hào)管 15.63pg/ml

7號(hào)管 7.81pg/ml

8號(hào)管 0pg/ml（試驗(yàn)樣品空白）

吸取230ul的標(biāo)準(zhǔn)品于1號(hào)管混勻，然后從1號(hào)管吸取230ul加入2號(hào)管，依次連續(xù)稀釋，標(biāo)準(zhǔn)品范圍為500~7.81ng/ml

內(nèi)部實(shí)驗(yàn)步驟（4℃下孵育過夜）

高靈敏度所必須的操作步驟

1）標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：吸取2.0ml的去離子水至標(biāo)準(zhǔn)品瓶內(nèi)，充分混勻，得到500pg/ml的人G-CSF標(biāo)準(zhǔn)品

2）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：準(zhǔn)備9個(gè)試管用于標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋，每管加入230ul的EIA緩沖液

每管的濃度如下

1號(hào)管 250 pg/ml

2號(hào)管 125pg/ml

3號(hào)管 62.5pg/ml

4號(hào)管 31.25pg/ml

5號(hào)管 15.63pg/ml

6號(hào)管 7.81pg/ml

7號(hào)管 3.91pg/ml

8號(hào)管 1.95pg/ml

8號(hào)管 0pg/ml（試驗(yàn)樣品空白）

吸取230ul的標(biāo)準(zhǔn)品于1號(hào)管混勻，然后從1號(hào)管吸取230ul加入2號(hào)管，依次連續(xù)稀釋，標(biāo)準(zhǔn)品范圍為250~1.95pg/ml,9號(hào)管為試驗(yàn)樣品空白

5. 樣品稀釋：樣品用EIA緩沖液稀釋。如果樣品濃度事先沒有建立，我們建議，先用幾個(gè)不同稀釋比例的樣品進(jìn)行檢測，來確定樣品*稀釋比例

實(shí)驗(yàn)步驟

使用前，所有樣品應(yīng)平衡至室溫，大約30min，然后充分混勻，確保試劑質(zhì)量無變化，標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品檢測同時(shí)進(jìn)行

如圖：

1. Reagent Blank孔內(nèi)加入100ul的EIA緩沖液

2. 將試驗(yàn)樣品空白對(duì)照，樣品和稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品加100ul至相應(yīng)的孔內(nèi)；（內(nèi)部操作程序一樣）

3. 蓋板，37℃下孵育1小時(shí)（4℃下孵育過夜）

4. 洗板，重復(fù)7次以上，吸水紙上拍干；洗板機(jī)則洗板4次

5. 每孔加入100ul的標(biāo)記抗體液，除Reagent Blank孔外

6. 蓋板，37℃下孵育30min

7. 洗板9次，同步驟四

8. 吸取試驗(yàn)所需的TMB底物液于一次性試管內(nèi)，每孔加入100ul的TMB底物液。剩余的TMB底物液不能再放回至原裝瓶內(nèi)，避免污染

9. 黑暗處，室溫下孵育30min，溶液變藍(lán)

10. 每孔加入100ul的終止液，溶液變藍(lán)

11. 擦去微孔板底部的污點(diǎn)或水滴，終止液加入后30min內(nèi)，在酶標(biāo)儀450nm處讀數(shù)

特別注意

1. 試驗(yàn)樣品采集后應(yīng)立即檢測，凍存的樣品避免反復(fù)凍融，檢測前應(yīng)先將其*溶解混勻

2. 試驗(yàn)樣品用EIA緩沖液稀釋

3. 試驗(yàn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)做雙份檢測

4. 試驗(yàn)樣品應(yīng)在中性PH范圍，有機(jī)溶劑的污染可能會(huì)影響檢測

5. 只能用試劑盒提供的洗滌液洗板，否則會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)失敗

6. 吸水紙上拍干微孔板，不能擦拭

7. TMB底物液應(yīng)貯存于黑暗處，因其對(duì)光敏感，且避免接觸金屬

8. 加入終止液后30min內(nèi)必須酶標(biāo)儀讀數(shù)

結(jié)果計(jì)算

繪制曲線前，所有的數(shù)據(jù)都應(yīng)減去試驗(yàn)樣品空白值，包括標(biāo)準(zhǔn)品和未知的樣品。以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值和濃度在對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可直接讀取未知樣品的濃度

附：采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測，只需檢測前設(shè)置好酶標(biāo)儀的相關(guān)參數(shù)，如坐標(biāo)參數(shù)（線性，半對(duì)數(shù)）和計(jì)算方式參數(shù)（三次回歸、四參數(shù)或雙對(duì)數(shù)曲線方程），即可直接得到結(jié)果

附錄一：