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            幾種常用轉化細胞的轉化

            閱讀:2896      發布時間:2010-3-15
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            幾種常用轉化細胞和轉化技術



             

            1)致癌化學物轉化細胞:轉化敘利亞地鼠胚胎細胞實驗
            1.取材:妊娠后第13天取材,取數個同窩胚胎,去頭和內臟,在無菌條件下剪碎至米粒大小,再用0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)37℃消化30分鐘,濾過、低速離心、吸除消化液、加入營養液、制備成細胞懸液、接種入75cm/培養瓶中,接種密度10~20×106/75cm,37℃培養2~3天,在順利情況下能迅速長滿瓶面。
            2.貯存:選大批生長狀態良好的細胞凍存,儲以備用。
            3.致癌物處理:取凍存細胞,解凍,接種于25ml培養瓶中,每瓶含細胞10萬~30萬。待細胞生長進入指數增生期時,向培養瓶中加入致癌劑MNNG。致癌劑量1~3微克/毫升營養液。在37℃溫箱中培養12~48小時。
            4.低血清培養:棄掉MNNG作用液,用溫PBS洗1~3次,加入含20%小牛血清,繼續置溫箱中培養2~3周,然后改用含5%血清培養液培養。低血清培養液不利于正常細胞生長,但已轉化的細胞仍能增殖和形成轉化灶。
            5.轉化灶形成和分離:在成功情況下,用致癌物處理過的細胞于10天后在正常細胞之間,可產生數量不等的轉化灶。

            2)病毒轉化細胞
            1.血液制備:檸檬酸(Citric Acide)或肝素抗凝取血1~2ml,分裝入管中,每管0.5ml全血,置于4℃冰箱中30分鐘。
            2.EBV病毒轉化:從液氮中取出凍存的0.5ml全血,在37℃水中迅速解凍。
            3.將解凍細胞與10ml不含血清的RPMI 1640混合,2500 rpm離心2分鐘,棄上清,用含20%的胎牛血清、青、鏈霉素和慶大霉素的RPMI 1640生長培養基重懸細胞。
            4.加入0.3~0.5ml的EBV病毒液,37℃水浴30分鐘~2小時,并不時搖動,以免出現凝塊。
            5.分裝入50ml的培養瓶中,同時補加適量培養液,置入含5%CO2溫箱中,100%溫度下培養。
            6.一周后加補入2ml培養基。
            7.經常鏡檢培養物,每3~4天加液或換液,隨細胞數量增多,可分裝入大瓶中培養。

            3)  癌基因轉化細胞:基因組DNA轉染法
            1.提取基因DNA(含癌基因)。
            2.DNA準備:取供體DNA50~100微克,加3M NaCl或醋酸鈉使終濃度至0.3M混勻。
            3.再加2倍體積無水乙醇,3000轉/分離心10分鐘,去上清。
            4.加入轉染緩沖液,待DNA充分融解后,再加入2.5M CaCl2,令終濃度為125mM,用吸管輕輕吹打三次。置室溫下10~30分鐘,待液體透明度降低,出現微濁藍色時,即可用于轉染受體細胞。
            5.細胞:取生長狀態良好、處于半匯合階段的指數增生期細胞,在轉染前24小時,更換培養液1次。
            6.轉染:向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉淀物0.5~1ml/瓶,置37℃作用4~6小時。
            7.培養:棄去培養液,用15%甘油處理3分鐘,無血清培養漂洗1次,加入新培養液,37℃溫箱培養24小時。
            8.傳代:按1:5或1:10分瓶傳代,每2~3天換液1次,接近匯合時血清用量降至5%,培養2~3周。
            9.檢測:逐日觀察,待出現轉化灶后,分離入另瓶中培養。
             

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