膽汁酸被認(rèn)為是一類重要的生物標(biāo)志物，或者被認(rèn)為可在代謝性疾病的治療中發(fā)揮作用。由于膽汁酸存在多種異構(gòu)體以及檢測方法靈敏度的限制，同時進(jìn)行多種膽汁酸定量分析的工作仍是一個挑戰(zhàn)。島津中國創(chuàng)新中心與北京大學(xué)第三醫(yī)院藥物臨床試驗機(jī)構(gòu)劉東陽研究員課題組合作開發(fā)一種準(zhǔn)確、靈敏的液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），以進(jìn)行多種極性相近膽汁酸的同時定量檢測。通過將開發(fā)的定量分析進(jìn)一步應(yīng)用于健康人群血漿樣本的測試，對其中35個膽汁酸進(jìn)行定量分析，用以觀察葡萄糖攝入后血漿中膽汁酸的動態(tài)分布特征。相關(guān)成果以“Isomers-oriented separation of forty-five plasma bile acids with liquid chromatography-tandem mass spectrometry"為題，發(fā)表在化學(xué)期刊《Journal of Chromatography A》(doi.org/10.1016/j.chroma.2024.464827)
背景介紹
膽汁酸(Bile acids, BAs)由肝臟合成，膽囊分泌，可分為游離膽汁酸和結(jié)合膽汁酸，以及初級膽汁酸和次級膽汁酸。膽汁酸從膽固醇起始，通過細(xì)胞色素酶（CYP酶）的兩種合成途徑，最終形成初級膽汁酸，即膽酸(CA)和鵝去氧膽酸(CDCA)。這些初級膽汁酸在肝臟中與甘氨酸或牛磺酸反應(yīng)形成結(jié)合膽汁酸，儲存在膽囊中，隨膽汁排入腸道。在腸道微生物群的作用下，結(jié)合膽汁酸被水解，重新生成游離膽汁酸，游離膽汁酸經(jīng)過氧化還原反應(yīng)生成次級膽汁酸，如脫氧膽酸(DCA)、熊去氧膽酸(UDCA)和石膽酸(LCA)，大多數(shù)膽汁酸會被腸道重吸收并進(jìn)入腸肝循環(huán)。
近年來研究結(jié)果表明，膽汁酸與代謝紊亂（包括葡萄糖和脂質(zhì)代謝以及能量平衡）中的生理變化密切相關(guān)，在生理和病理方面發(fā)揮著重要作用，因此人體血漿中的膽汁酸的定性和定量研究至關(guān)重要。然而目前分析方法在膽汁酸異構(gòu)體的分離和靈敏度上無法兼顧，這為多種膽汁酸的同時定量提出了更高的分析要求。
本研究建立了LC-MS/MS同時定量人體血漿樣品中45種膽汁酸的分析方法。該方法以異構(gòu)體分離為導(dǎo)向，使用9種穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，經(jīng)過對色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化后，可同時準(zhǔn)確定量分析45種膽汁酸的人體血漿濃度，并保證均獲得0.05-10 ng/mL的定量下限。系統(tǒng)適用性、線性相關(guān)系數(shù)、可靠性、準(zhǔn)確度和精密度等相關(guān)結(jié)果，均滿足方法學(xué)要求，本研究所建立的質(zhì)譜定量方法具有較高的靈敏度和更高的分離能力。
實驗條件：
本工作使用島津液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜LCMS-8060NX進(jìn)行方法開發(fā)、驗證及實驗樣品檢測。
LC分離參數(shù)：
流動相A：水+0.01%甲酸；流動相B：乙腈+0.01%甲酸
色譜柱：ACE EXCEL 1.7 C18 (2.1mm*100mm, 1.7μm)
流速：0.25mL/min
柱溫：45℃
進(jìn)樣量：3μL
質(zhì)譜檢測參數(shù)：
離子化模式：ESI，負(fù)離子模式；霧化氣：2L/min;干燥氣：10L/min; 加熱氣：10L/min; 接口溫度：300℃；
脫溶劑管線DL溫度：250℃；加熱模塊溫度：400℃。
實驗結(jié)果
圖2顯示45種目標(biāo)膽汁酸及9種內(nèi)標(biāo)的MRM離子流圖，各化合物得到良好分離，且無明顯干擾。對該方法進(jìn)行方法學(xué)驗證，獲得良好的系統(tǒng)適用性、基質(zhì)效應(yīng)、殘留效應(yīng)、稀釋可靠性、準(zhǔn)確度、精密度、線性及穩(wěn)定性結(jié)果，證明分析方法的可靠性。
對進(jìn)行靜脈葡萄糖耐量試驗（IVGTT）的12個健康中國志愿者在不同時間點(基線區(qū)間及攝入葡萄糖后，0-240min)采集的共180個血漿樣品進(jìn)行檢測。共計35種膽汁酸被檢出，其中27種符合定量分析標(biāo)準(zhǔn)要求(在超過2/3的個體樣品中可被準(zhǔn)確定量分析)。代表性膽汁酸的濃度-時間變化曲線如圖3所示。根據(jù)檢測結(jié)果，在進(jìn)行糖分?jǐn)z入后，游離型膽汁酸與結(jié)合型膽汁酸顯示不同的變化規(guī)律。游離型膽汁酸濃度在整個實驗過程中持續(xù)性下降，而同時結(jié)合型膽汁酸會在起始階段先出現(xiàn)下降而后在特定時間點發(fā)生反彈，表明存在不同的因素影響兩種類型膽汁酸發(fā)生變化。
對比IVGTT過程中膽汁酸濃度-時間曲線與血糖濃度變化趨勢，圖4對比了游離型膽汁酸CDCA、結(jié)合型膽汁酸TCA以及總膽汁酸與血糖、胰島素的變化過程。在給予靜脈葡萄糖注射后，游離型膽汁酸與葡萄糖均呈現(xiàn)快速的清除速率，顯示血漿中濃度的快速下降。結(jié)合型膽汁酸在注射葡萄糖60min內(nèi)顯示與游離膽汁酸類似的變化趨勢，但是之后出現(xiàn)濃度的明顯上升。總膽汁酸的變化趨勢與游離型膽汁酸CDCA的變化趨勢更加接近。
小結(jié)：
綜上所述，本工作基于島津液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法（LC-MS/MS）建立了同時準(zhǔn)確定量生物樣本中45種膽汁酸的分析方法，并將該方法進(jìn)一步應(yīng)用于檢測葡萄糖耐受實驗后健康人群血漿中膽汁酸的變化。研究結(jié)果表明，膽汁酸、葡萄糖和胰島素的變化之間存在一定的相關(guān)性，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究調(diào)查。
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