GB4789.13-2012 食品微生物學檢驗產氣莢膜梭菌檢驗

                                                  中華人民共和國國家標準
                                                      GB 4789.13—2012
                                                       食品安全國家標準
                                        食品微生物學檢驗產氣莢膜梭菌檢驗
中華人民共和國衛生部發布
2012-05-17 發布2012-07-17 實施
GB 4789.13—2012
I
前言
本標準代替GB/T 4789.13—2003《食品衛生微生物學檢驗產氣莢膜梭菌檢驗》。
本標準與GB/T 4789.13—2003 相比，主要變化如下：
——修改了標準的中文名稱；
——修改了樣品制備過程；
——修改了培養基與試劑；
——修改了操作步驟；
——修改了菌數計算部分；
——增加了附錄A。
GB 4789.13—2012
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食品安全國家標準
食品微生物學檢驗產氣莢膜梭菌檢驗
1 范圍
本標準規定了食品中產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）的檢驗方法。
本標準適用于食品中產氣莢膜梭菌的檢驗。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
a） 恒溫培養箱：36 ℃±1 ℃；
b） 冰箱：2 ℃～5℃；
c） 恒溫水浴箱：50℃±1 ℃，46℃±0.5℃；
d） 天平：感量0.1 g；
e） 均質器；
f） 顯微鏡：10×～100×；
g） 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭；
h） 無菌試管：18mm×180mm；
i） 無菌培養皿：直徑90 mm；
j） pH 計或pH 比色管或精密pH 試紙；
k） 厭氧培養裝置。
3 培養基和試劑
3.1 胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸（TSC）瓊脂：見附錄A 中A.1。
3.2 液體硫乙醇酸鹽培養基（FTG）：見附錄A 中A.2。
3.3 緩沖動力-硝酸鹽培養基：見附錄A 中A.3。
3.4 乳糖-明膠培養基：見附錄A 中A.4。
3.5 含鐵牛乳培養基：見附錄A 中A.5。
3.6 0.1%蛋白胨水：見附錄A 中A.6。
3.7 革蘭氏染色液：見附錄A 中A.7。
3.8 硝酸鹽還原試劑：見附錄A 中A.8。
3.9 緩沖甘油-氯化鈉溶液：見附錄A 中A.9。
4 檢驗程序
GB 4789.13—2012
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產氣莢膜梭菌檢驗程序見圖1。

5 操作步驟
5.1 樣品制備
5.1.1 樣品采集后應盡快檢驗，若不能及時檢驗，可在2 ℃～5 ℃保存；如8 h 內不能進行檢驗，應以
無菌操作稱取25 g（mL）樣品加入等量緩沖甘油-氯化鈉溶液（液體樣品應加雙料），并盡快至于-60 ℃
低溫冰箱中冷凍保存或加干冰保存。
5.1.2 以無菌操作稱取25 g（mL）樣品放入含有225 mL 0.1%蛋白胨水（如為5.1.1 中冷凍保存樣品，
室溫解凍后，加入200 mL 0.1%蛋白胨水）的均質袋中，在拍擊式均質器上連續均質1 min～2 min；或
置于盛有225 mL0.1%蛋白胨水的均質杯中，8 000 r/min～10 000 r/min 均質1min～2 min，作為1:10 稀釋
液。
5.1.3 以上述1:10 稀釋液按1 mL 加0.1%蛋白胨水9 mL 制備10-2～10-6 的系列稀釋液。
檢樣
25g(mL)檢樣+225 mL0.1%蛋白胨水
均質、稀釋
10-1～10-6 稀釋液各1mL + TSC 瓊脂混合
厭氧培養，36℃±1℃、20h～24h，黑色菌落計數
任選黑色菌落5 個，分別接種FTG 培養基
確證試驗
鏡檢形態 牛奶發酵 動力-硝酸鹽 乳糖-明膠
報告
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5.2 培養
5.2.1 吸取各稀釋液1 mL 加入無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平行。每個平皿傾注冷卻至50 ℃的TSC
瓊脂（可放置于50 ℃±1 ℃恒溫水浴箱中保溫）15 mL，緩慢旋轉平皿，使稀釋液和瓊脂充分混勻。
5.2.2 上述瓊脂平板凝固后，再加10 mL 冷卻至50 ℃的TSC 瓊脂（可放置于50 ℃±1 ℃恒溫水浴箱
中保溫）均勻覆蓋平板表層。
5.2.3 待瓊脂凝固后，正置于厭氧培養裝置內，36 ℃±1 ℃培養20 h～24 h。
5.2.4 典型的產氣莢膜梭菌在TSC 瓊脂平板上為黑色菌落。
5.3 確證試驗
5.3.1 從單個平板上任選5 個（小于5 個全選）黑色菌落，分別接種到FTG 培養基，36 ℃±1 ℃培養
18 h～24 h。
5.3.2 用上述培養液涂片，革蘭氏染色鏡檢并觀察其純度。產氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性粗短的桿菌，有
時可見芽孢體。如果培養液不純，應劃線接種TSC 瓊脂平板進行分純，36 ℃±1 ℃厭氧培養20 h～24 h，
挑取單個典型黑色菌落接種到FTG 培養基，36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h，用于后續的確證試驗。
5.3.3 取生長旺盛的FTG 培養液1 mL 接種于含鐵牛乳培養基，在46 ℃±0.5 ℃水浴中培養2 h 后，每
小時觀察一次有無“暴烈發酵”現象，該現象的特點是乳凝結物破碎后快速形成海綿樣物質，通常會上
升到培養基表面。5 h 內不發酵者為陰性。產氣莢膜梭菌發酵乳糖，凝固酪蛋白并大量產氣，呈“暴烈發
酵”現象，但培養基不變黑。
5.3.4 用接種環（針）取FTG 培養液穿刺接種緩沖動力-硝酸鹽培養基，于36 ℃±1 ℃培養24 h。在透
射光下檢查細菌沿穿刺線的生長情況，判定有無動力。有動力的菌株沿穿刺線呈擴散生長，無動力的菌
株只沿穿刺線生長。然后滴加0.5 mL 試劑甲和0.2 mL 試劑乙以檢查亞硝酸鹽的存在。15 min 內出現紅
色者，表明硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽；如果不出現顏色變化，則加少許鋅粉，放置10 min，出現紅色者，
表明該菌株不能還原硝酸鹽。產氣莢膜梭菌無動力，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。
5.3.5 用接種環（針）取FTG 培養液穿刺接種乳糖-明膠培養基，于36 ℃±1 ℃培養24 h，觀察結果。
如發現產氣和培養基由紅變黃，表明乳糖被發酵并產酸。將試管于5 ℃左右放置1 h，檢查明膠液化情況。
如果培養基是固態，于36 ℃±1 ℃再培養24 h，重復檢查明膠是否液化。產氣莢膜梭菌能發酵乳糖，使
明膠液化。
6 結果與報告
6.1 典型菌落計數
選取典型菌落數在20 CFU～200 CFU 之間的平板，計數典型菌落數。如果：
a) 只有一個稀釋度平板的典型菌落數在20CFU～200CFU 之間，計數該稀釋度平板上的典型菌落；
b）低稀釋度平板的典型菌落數均小于20 CFU，計數該稀釋度平板上的典型菌落；
c）某一稀釋度平板的典型菌落數均大于200 CFU，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應計數該稀
釋度平板上的典型菌落；
d）某一稀釋度平板的典型菌落數均大于200 CFU，且下一稀釋度平板上有典型菌落，但其平板上的
典型菌落數不在20 CFU～200 CFU 之間，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；
e）2 個連續稀釋度平板的典型菌落數均在20CFU～200CFU 之間，分別計數2 個稀釋度平板上的典
型菌落。
6.2 結果計算
6.1 計數結果按公式（1）計算：
GB 4789.13—2012

式中：
T——樣品中產氣莢膜梭菌的菌落數；
A——單個平板上典型菌落數；
B——單個平板上經確證試驗為產氣莢膜梭菌的菌落數；
C——單個平板上用于確證試驗的菌落數；
n1 ——稀釋度（低稀釋倍數）經確證試驗有產氣莢膜梭菌的平板個數；
n2 ——第二稀釋度（高稀釋倍數）經確證試驗有產氣莢膜梭菌的平板個數；
0.1——稀釋系數；
d——稀釋因子（稀釋度）。
6.3 報告
根據TSC 瓊脂平板上產氣莢膜梭菌的典型菌落數，按照6.2 中公式計算，報告每g（mL）樣品中產
氣莢膜梭菌數，報告單位以CFU/ g（mL）表示；如T 值為0，則以小于1 乘以低稀釋倍數報告。

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附錄A
培養基和試劑
A.1 胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸（TSC）瓊脂
A.1.1 基礎成分
胰胨15.0 g
大豆胨5.0 g
酵母粉5.0 g
焦亞硫酸鈉1.0 g
檸檬酸鐵銨1.0 g
瓊脂15.0 g
蒸餾水900.0 mL
pH 7.6±0.2
A.1.2 D-環絲氨酸溶液
溶解1 gD-環絲氨酸于200 mL 蒸餾水，膜過濾除菌后，于4 ℃冷藏保存備用。
A.1.3 制法
將基礎成分加熱煮沸至*溶解，調節pH，分裝到500 mL 燒瓶中，每瓶250 mL，121 ℃高壓滅菌
15 min，于50 ℃±1 ℃保溫備用。臨用前每250 mL 基礎溶液中加入20 mL D-環絲氨酸溶液，混勻，傾注
平皿。
A.2 液體硫乙醇酸鹽培養基（FTG）
A.2.1 成分
胰蛋白胨15.0 g
L-胱氨酸0.5g
酵母粉5.0 g
葡萄糖5.0 g
氯化鈉2.5g
硫乙醇酸鈉0.5g
刃天青0.001g
瓊脂0.75g
蒸餾水1 000.0 mL
pH 7.1±0.2
A.2.2 制法
將以上成分加熱煮沸至*溶解，冷卻后調節pH，分裝試管，每管10 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。
臨用前煮沸或流動蒸汽加熱15 min，迅速冷卻至接種溫度。
A.3 緩沖動力-硝酸鹽培養基
A.3.1 成分
蛋白胨5.0 g
牛肉粉3.0 g
硝酸鉀5.0 g
磷酸氫二鈉2.5g
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半乳糖5.0 g
甘油5.0 mL
瓊脂3.0 g
蒸餾水1 000.0 mL
pH 7.3±0.2
A.3.2 制法
將以上成分加熱煮沸至*溶解，調節pH，分裝試管，每管10 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。如果
當天不用，置4 ℃左右冷藏保存。臨用前煮沸或流動蒸汽加熱15 min，迅速冷卻至接種溫度。
A.4 乳糖-明膠培養基
A.4.1 成分
蛋白胨15.0 g
酵母粉10.0 g
乳糖10.0 g
酚紅0.05g
明膠120.0 g
蒸餾水1 000.0 mL
pH 7.5±0.2
A.4.2制法
加熱溶解蛋白胨、酵母粉和明膠于1000 mL 蒸餾水中，調節pH，加入乳糖和酚紅。分裝試管，每
管10 mL，121 ℃高壓滅菌10 min。如果當天不用，置4 ℃左右冷藏保存。臨用前煮沸或流動蒸汽加熱
15 min，迅速冷卻至接種溫度。
A.5 含鐵牛乳培養基
A.5.1 成分
新鮮全脂牛奶1 000.0 mL
硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O） 1.0 g
蒸餾水50.0 mL
A.5.2 制法
將硫酸亞鐵溶于蒸餾水中，不斷攪拌，緩慢加入1000 mL 牛奶中，混勻。分裝大試管，每管10 mL，
118 ℃高壓滅菌12 min。本培養基必須新鮮配制。
A.6 0.1% 蛋白胨水
A.6.1 成分
蛋白胨1.0 g
蒸餾水1 000.0 mL
pH 7.0±0.2
A.6.2制法
加熱溶解，調節pH，121 ℃高壓滅菌15 min。
A.7 革蘭氏染色液
A.7.1 結晶紫染色液
A.7.1.1 成分
結晶紫1.0g
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95%乙醇20.0 mL
1%草酸銨水溶液80.0 mL
A.7.1.2 制法
將結晶紫*溶于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。
A.7.2 革蘭氏碘液
A.7.2.1 成分
碘1.0 g
碘化鉀2.0 g
蒸餾水300.0 mL
A.7.2.2 制法
將碘與碘化鉀先混合，加入蒸餾水少許振搖，待*溶解后，再加入蒸餾水至300 mL。
A.7.3 沙黃復染液
A.7.3.1 成分
沙黃0.25 g
95%乙醇10.0 mL
蒸餾水90.0 mL
A.7.3.2 制法
將沙黃溶解于95%乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。
A.7.4 染色方法
涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染液，染色1 min，水洗。滴加革蘭氏碘液，作用1 min，水洗。滴
加95%乙醇脫色約15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。滴加沙黃復染液，復染1 min，
水洗、待干、鏡檢。
A.8 硝酸鹽還原試劑
A.8.1 甲液（對氨基苯磺酸溶液）
在1 000 mL 5 mol/L 乙酸中溶解8 g 對氨基苯磺酸。
A.8.2 乙液（α-萘酚乙酸溶液）
在1 000 mL 5 mol/L 乙酸中溶解5 g α-萘酚。
A.9 緩沖甘油-氯化鈉溶液
A.9.1 成分
甘油100.0 mL
氯化鈉4.2 g
磷酸氫二鉀（無水） 12.4 g
磷酸二氫鉀（無水） 4.0 g
蒸餾水900.0 mL
pH7.2±0.1
A.9.2 制法
將以上成分加熱至*溶解，調節pH，121 ℃高壓滅菌15 min。配制雙料緩沖甘油溶液時，用甘油
200 mL和蒸餾水800 mL。