生活飲用水標準之微生物的檢測方法

檢測依據：
      GB/T 5750.2-2006 生活飲用水標準檢驗方法 水樣的采集和保存
      GB/T 5750.12-2006 生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標

本文主要包含
   1. 生活飲用水中的微生物指標
   2. 水樣采集規則及注意事項
   3. 菌落總數、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌的測定方法
   4. 對所檢測水樣的綜合分析

生活飲用水中的微生物指標

菌落總數

水樣在營養瓊脂上有氧環境下，37℃培養48h后，所得1mL水樣所含菌落的總數。

檢測意義：作為一般性污染的指標，即評價被檢樣品的微生物污染程度和安全性。水樣菌落總數越多，說明水被微生物污染程度越嚴重，病原微生物存在的可能性越大，但不能說明污染的來源。

總大腸菌群

指一群在37℃培養24h能發酵乳糖，產酸產氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。

檢測意義：作為糞便污染的指標。水樣總大腸菌群的含量，表明水被糞便污染的程度，而且間接地表明有腸道致病菌存在的可能。

耐熱大腸菌群

指一群在44-44.5℃培養24h能發酵乳糖，產酸產氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。我國習慣上稱之為“糞大腸菌群"。

微生物指標常規檢驗流程圖

一、水樣采集

采樣原則：所采集的樣品具有代表性。

采樣容器：不能是新的污染源：不吸收或吸附某些待測組分不與待測組分發生反應。保證從采樣到分析期間樣品各組分的濃度不發生改變。

微生物樣品必須按一般無菌操作的基本要求采集，并保證在運送、貯存過程中不受污染。

自來水水樣：先將自來水龍頭用火焰燒灼3min滅菌再開放水龍頭使水流5min(經常用水的水龍頭放水1~3min)后，采集水樣于無菌玻璃瓶，約占瓶容量80%，以便搖勻水樣。

水源水水樣：選有代表性的地點及可疑地方，一般距水面下10-15cm采集，采樣后在水中改好蓋子，再從水中取出。

注意事項

1. 嚴格無菌操作。

2. 做好標記：采得水樣后應立即記錄水樣名稱、地點、時間等內容。

3. 從速送檢。水樣從采集到檢驗不應超過2h，在4℃下保存不應超過24h。

二、菌落總數測定

所需培養基和試劑：營養瓊脂、9mL無菌生理鹽水管。

自來水水樣檢測

操作步驟：

1. 以無菌操作方法用滅菌吸管吸取1mL充分混勻的水樣，注入滅菌平皿中。

2. 傾注約15mL已融化井冷卻到45℃左右的營養瓊脂培養基，并立即旋搖平皿；使水與培養基充分混勻（每次檢驗時應做一平行接種，同時另用一個平只傾注營養瓊脂養基作為空白對照）

3. 待冷卻凝固后，翻轉平皿，使底面向上，置于36℃±1℃培養箱內培養48h，進行菌落計數，即為水樣1mL中的菌落總數。

4. 培養完成后，用眼睛直接觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。

結果分析與報告：

計算平均菌落數，若菌落總數(CFU/mL)當檢樣的菌落數為1~100時，按實有數報告；大于100時，采用二位有效數字報告。

國家標準(GB5749-2006)規定生活飲用水菌落總數每毫升不得超過100個。

水源水檢測

操作步驟：

1. 以無操作方法吸取1mL充分混勻的水，注入盛有9mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成1:10稀釋液。

2. 吸取1:10的稀釋液1mL，注入盛有9mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成1:100稀師液，按同法依次稀釋成1:1000，1:1000釋液等備用（如此遞增稀釋一次，必須更換一支1m滅菌管）。

3. 然后用無菌極管取稀釋的水樣和2個~3個適釋度的水樣1mL，分別注入滅菌平皿內。之后操作同自來水水樣的檢驗步驟。

結果分析與報告：計算平均菌落數，首先選擇平均菌落在30~300之間者進行計算。

一般水源水中菌落總數與水清潔程度的關系：

注意事項

1. 菌落總數測定中，應選擇合適的稀釋度進行(生活飲用水，國家標準規定每毫升不得超過100個，因此以直接吸取1毫升到平板進行培養)

2. 各稀釋管、相應半皿做好標記。包括：水樣名稱、稀釋度、時間、小組。

3. 嚴格無菌操作進行水樣稀釋時，每一稀釋度均需更換吸管。

4. 傾注時，要注意營養瓊脂的溫度。

5. 傾入瓊脂后要混勻，待瓊脂凝固后倒置培養。

三、總大腸菌群測定

所需培養基和試劑：乳糖蛋白胨培養液、雙料乳糖蛋白胨培養液、伊紅美藍培養基。

多管發酵法步驟：

初步發酵試驗：采用乳糖蛋白培養液36℃±1℃培養24h觀察產酸產氣情況。

平板分離：對陽性管培養物，接種于伊紅美藍培養基觀察菌落特征，并進行革蘭氏染色和鏡檢。

復發酵證實試驗：對典型和可疑菌落，接種于乳糖蛋白胨培養液，進行復發酵證實試驗。

結果報告(MPN)：根據 GB 5750.12-2006 所附檢索表報告結果。

四、耐熱大腸菌群測定

所需培養基和試劑：乳糖蛋白胨培養液、EC肉湯、伊紅美藍培養基

多管發酵法步驟：

初步發酵試驗：采用乳糖蛋白培養液36℃±1℃培養24h觀察產酸產氣情況。

耐熱培養：陽性管接種在EC肉湯管中，44.5℃培養24h觀察產酸產氣情況。

平板培養：陽性管接種在EMB平板上，36℃±1℃培養24h。

結果報告(MPN)：根據 GB 5750.12-2006 所附檢索表報告結果。

五、大腸埃希氏菌測定

所需培養基和試劑：EC-MUG培養基

多管發酵法步驟：

耐熱培養：將總大腸菌群初發酵中產酸或產氣的管進行大腸埃希氏菌檢測，接種此類試管中的液體到EC-MUG管中，在培養箱或恒溫水浴中44.5℃培養24h。如使用恒溫水浴，在接種后30min內進行培養，使水浴液面超過EC-MUG管的液面。

結果報告(MPN)：
   將培養后的EC-MUG管在暗處用366nm紫外燈照射，如有藍色熒光，則表明水樣中含有大腸埃希氏菌。
   計算EC-MUG陽性管數，根據GB 5750.12-2006所附檢索表報告結果。