實驗室質控菌株復蘇保存相關常見問答

1.菌株保存的是第三代，-80℃保存，再取出來活化的話屬于第幾代？

答：保存的是第三代復活出來后，如果采用平板或肉湯活化相當于轉接了一代，就是第四代，如果還在瓷珠里的話就還是原來的代數。如果是保存在斜面上，這一支斜面一直就是第三代，如果轉接到另一支斜面就是第四代。傳代原則，菌株活化復蘇不論以任何形式繁殖了一次就算是傳了一代。但如果僅是物理位置的轉移沒有繁殖就不是傳代。

2.菌株傳代保存到瓷珠里一定要挑單菌落嗎？

答：不一定非挑單菌落，但是一定要挑相同特征的菌落，就是說從同一個菌落純化出來的，以保證它們的特性一致。原則是盡量多挑，寧多勿少。

3.菌株冷凍保存是-70℃還是-80℃有具體標準規定么？

答：有標準?！禨N/T 2632-2010 微生物菌株常規保藏技術規程》是關于菌株保藏的一個標準，大家可以學習一下，各個保存方式都有介紹，但是瓷珠是比較新興的保存方式暫時里面還沒有收錄。GB4789.28-2013建議長期冷凍儲存是在不高于-70℃條件下。

4.怎樣延長菌株的保存時間呢？

答：大量的實驗證明菌株在低溫、干燥、缺氧、缺營養的條件下保存效果是很好的，越接近這種保存條件，菌株的保存時間越長。例如甘油凍存管，在-80℃保存時間大于在-20℃。凍干菌粉在-20℃保存時間會比2~8℃長。

5.怎樣純化菌株？

答：純化就是從可疑菌落平板上挑取單菌落再劃線到合適的非選擇性平板（如TSA、NA等）上，分離出單菌落的過程。

6. 我們只保存第一代菌株是不是要重新傳代保存呢，認證老師會不會認為這是個錯誤？

答：一般情況下認證老師不會提出這種問題。最佳儲存方式應該是，制備第一代菌株的甘油凍存管，置于超低溫冰箱進行長期保存。第二代菌株作為工作儲備菌株，進行斜面保存。使用第二代工作儲備菌株進行轉接后為第三代工作菌株。

7. 為何要將第三代作為工作菌株？

答：菌株在多次傳代后，菌株的變異概率會大大增加，因此菌株傳代需控制在五代以內，而第一代菌株通常相對不穩定，需傳至第三代使菌株穩定。因此實際工作中通常選擇第三代菌株作為工作菌株。

8. 質控菌株是不是傳代超過五代就必須銷毀處理？

答：不一定。傳代超過五代只是存在菌種變異可能，但如果傳代到第六代、第七代……經過形態、生化特性、DNA特征等驗證，性狀保持穩定，那么這些五代后的菌還是可以正常使用。

9.菌種編號意義？

答：以金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003為例，CMCC為中國醫學菌種保藏中心縮寫，其它常見菌種保藏中心還包括ATCC（美國標準菌種收藏所）、CICC（工業微生物菌種保藏中心）、FSCC（食品安全菌種保藏中心）；B的意思是細菌，對應還有F（真菌）；26003為CMCC的保藏編號。

10.同樣是金黃色葡萄球菌，ATCC6538與ATCC25923有什么不同？

答：ATCC6538與ATCC25923均為來自美國標準菌種收藏所（ATCC）的菌株，不同的編號表明這兩株最初始的分離來源不同。但不同的編號的生化特性是否一樣，需要進行具體分析。比如在實際生物學檢驗中發現金黃色葡萄球菌ATCC6538溶血能力較ATCC25923要強。

11. 使用瓷珠保藏管保存菌株，加入菌液搖勻后為什么要吸干菌液？

答：瓷珠保存的原理為瓷珠為多孔結構，細菌吸附在瓷珠上，除去液體，則避免反復凍融時，液體冷凍過程中形成的冰晶損傷細菌，從而達到保護細菌的作用。如果不吸干菌液的話，那么瓷珠保存就達不到可以進行反復凍融的效果。

12. TSA斜面一般多少度保存，可以放在冷藏里嗎？

答：一般細菌的TSA斜面，2-8℃保存，即冷藏，但弧菌、綠膿桿菌、嗜水氣單胞菌等對低溫較敏感菌株，短期置于室溫20-25℃保存，長期保存需使用甘油管或者瓷珠凍存。

13.復蘇凍干菌株是否可以采用液體培養基？

答：可以，但使用液體復蘇的話只能觀察到培養基混濁，無法確定是否有污染。建議使用平板培養基復蘇凍干菌株，有助于簡單通過肉眼觀察菌落形態以分辨復蘇出來菌株是否存在污染，初步鑒定菌株純度。

14.復蘇凍干菌株是否可以采用顯色培養基？

答：不建議采用顯色培養基復蘇凍干菌株。凍干菌株在凍干過程中會受到一定的損傷，復蘇需要一個最適生長環境，故復蘇培養基不能選用含有抑菌成分不利于菌株復蘇的這類選擇性培養基（顯色培養基屬于選擇性培養基）。

15.產氣莢膜梭菌做凍存時是否需要保持厭氧狀態？

答：不需要。產氣莢膜梭菌雖屬厭氧性細菌，但對厭氧程度要求并不太嚴格，按照一般菌株凍存方法進行凍存即可。如果是凍存嚴格厭氧菌，則需特殊的凍存方法。