軍團菌檢測方法

   軍團菌是一種環(huán)境感染性致病菌，可引起急性呼吸道傳染病，即軍團菌病。軍團菌分布極其廣泛，醫(yī)院、酒店等的供水系統(tǒng)、空調(diào)的冷卻系統(tǒng)等各種水源均易于滋生、污染軍團菌，并造成軍團菌病傳染的風險。即與水有關(guān)的地方均可能存在軍團菌。

　　軍團菌傳播、感染有以下特點：

1、透過空氣、水份感染，傳播帶季節(jié)性，超過50%病例在夏季發(fā)生。

2、滋生在醫(yī)院、酒店的供水系統(tǒng)，通過過水、浴室傳播。

3、可通過空調(diào)的冷卻系統(tǒng)，由通風口傳播并感染對象。

　　軍團菌屬革蘭氏陰性桿菌，專性需氧，無芽孢，無莢膜，軍團菌需要半胱氨酸和鐵，無半胱氨酸時，軍團菌無法生長。生化特征還有不發(fā)酵也不氧化糖類，不還原硝酸鹽，氧化酶實驗陰性或弱陽性，尿素酶陰性，軍團菌生長的zui適pH為6.9-7.0，2%-5%CO2能促進部分菌株的生長。軍團菌生長緩慢，易于被其它菌落覆蓋。軍團菌的菌落顏色多樣，通常呈白色、灰色、藍色或紫色，也能顯深褐色、灰綠色、深紅色。菌落整齊，表面光滑，在紫外燈下，有熒光。目前軍團菌分為64種血清型及42個種。

 二、軍團菌的檢測方法---ISO11731:1998 

1.范圍

 本標準描述了一種用于軍團菌分離和估計環(huán)境樣品中軍團菌數(shù)量的培養(yǎng)方法。該方法適用于所有環(huán)境樣本，包括飲用水、工業(yè)用水和天然水以及沉淀物、沉積物和粘土/軟泥等相關(guān)樣本。

2.培養(yǎng)基和試劑

2.1：CP0020 BCYE平板（軍團菌生長平板）                 

2.2：P0030 BCYE-CYS平板（BCYE無L-半胱氨酸平板）      

2.3：CP0040 GVPC選擇性平板（軍團菌選擇性平板）       

2.4：酸處理緩沖液

3．取樣

3.1取樣容器

水樣可采用玻璃、聚乙烯或類似容器。以前用過的容器應該清洗干凈、扣干水分，121℃高壓滅菌15min。如果容器不能經(jīng)受高壓滅菌，應在高于70℃的流動熱水或流動蒸汽中處理至少5min。

3.2含生物防腐劑的樣品

如果水樣中含有或被認為含有氧化型生物防腐劑，應在取樣時或取樣前加入非活性試劑加以中和。如果水樣中含有消毒劑，需在采樣前或采樣后加入中和劑，含氯或氧化型消毒劑可用流代流酸鈉或硫代硫酸鉀作中和劑。原則上講，實驗室接到水樣后應盡快進行微生物學分析，是取樣當天，尤其對于已知含生物防腐劑的樣品。因此，建議從樣品采集到制備好濃縮樣的間隔為2d，不應超過5d，zui長不超過14d。

 3.3樣品運輸

樣品應在6-18℃條件下被運輸，應避免熱和光照，在1d內(nèi)，不超過2d將樣品送到實驗室。

4．制樣

4.1 總則

如果液體樣品軍團菌的數(shù)量估計超過105CFU/L，可以采用直接平板法，即直接涂布于GVPC平板。為了確保低于這個數(shù)量樣品中軍團菌的檢測，需采用濃縮技術(shù)。為了濃縮水樣，可采用膜過濾法（4.2）或離心法（4.3）。

4.2膜過濾法

如果樣品是渾濁的、乳濁的或有顏色的，應采用離心法。采用MFS型膜過濾裝置進行膜過濾，采用直徑47mm，孔徑0.22μm和0.45μm的無菌白底黑格膜。過濾后的膜應放置在帶蓋的無菌容器中，可用無菌剪刀剪碎，加5ml-25ml的無菌稀釋液或無菌去離子水，不斷搖動至少2min。也可將容器放入超聲波中2-10min。

4.3.離心法

取200ml樣品于300-500ml容積的離心瓶中，6000g離心10min或3000g離心30min，保持溫度在15-25℃，棄去上清液，將沉淀物懸浮在2-20ml無菌稀釋液或無菌去離子水中。

培養(yǎng)

5.1.將制備好的樣品（濃縮的或未濃縮的）分成3份，1份不做任何處理；1份進行熱處理；1份進行酸處理。

5.2熱處理：加1±0.5ml樣品于一無菌容器中，50±1℃水浴處理30±2min。

5.3.酸處理:加1-10ml樣品于一擰蓋的容器中，6000g離心10min或3000g離心30min，用無菌槍頭吸去一半體積的上清液，通過渦旋重新懸浮剩余物用酸處理緩沖液補足原始體積。混合靜置5±0.5min。

5.4.革蘭氏染色:團菌生長較慢，次日生長的菌落可直接棄去。軍團菌菌落顏色多樣，通常呈白色、灰色、藍色或紫色，也能顯深褐色、灰綠色、深紅色。菌落整齊，表面光滑，在紫外燈下有熒光。軍團菌為革蘭氏陰性桿菌。

5.4.菌落驗證:從每個平皿上選幾個可疑菌落，接種BCYE、BCYE-Cys平板和血平板進行傳代培養(yǎng)，凡在BCYE平板上生長，而在BCYE-Cys平板上不生長的菌極可能是軍團菌。

5.5.軍團菌計數(shù)：從三個GVPC平板中選擇確證菌數(shù)zui多的平板進行計數(shù)，再除以濃縮倍數(shù)，作為軍團菌數(shù)的估計值。