紅外顯微光譜法是非破壞性、結構敏感的檢測方法，目前已在基于分子結構的單細胞領域的研究中發揮重大作用，諸如蛋白構象改變、氧化還原、脂質體的產生與降解等。但是受制于紅外光譜儀本身的限制，對于生物組織樣品來說制樣非常困難，因此極大的限制了紅外光譜在生物醫學方面的應用。

O-PTIR (Optical Photothermal Infrared) 光學光熱紅外光譜是一種快速簡單的非接觸式光學技術，通過檢測由于本征紅外吸收引發的樣品表面快速的光熱膨脹或收縮，克服了傳統IR衍射的極限，空間分辨率可達500 nm。

近期，美國PSC公司又推出了非接觸亞微米分辨熒光紅外拉曼同步測量系統mIRage-LS，將O-PTIR技術與熒光（FL）進一步有機結合，利用落射熒光快速定位 O-PTIR 測量的區域，提供了對樣品熒光標記區域以及鄰近未標記組織的化學結構的快速光譜分析。

圖 1. FL-OPTIR 顯微鏡基本原理和觀測方法

這項全新的技術對樣品要求非常低，而紅外光譜的空間分辨率可達亞微米級別，為紅外光譜在生物醫學方面的應用提供了全新的視角。比如在阿爾茨海默病 (AD) 研究方面，AD的關鍵病理特征是淀粉樣蛋白折疊，這些 β-折疊結構具有特定的振動特征，對于紅外光譜來說十分敏感，但是受制于傳統紅外光譜儀本身的限制，在生物組織樣品上直接測量非常困難。而非接觸式的FL-PTIR技術卻能夠很好適用于這些樣品，并且已經有多個小組通過實驗證明了FL-PTIR能夠應用于具有特殊化學敏感性的活細胞成像研究。

Craig Prater等人通過這項技術成功實現了熒光定位下的OPTIR紅外觀測，并且完成了對組織中單個病理結構內的 β-折疊結構進行結構分析、在腦組織的特定細胞和培養的原代神經元分析。首先，作者使用了12個月周齡的 APP/PS1 轉基因小鼠的大腦切片，用淀粉樣蛋白特異性發光共軛聚電解質探針mytracker R（Ebba Biotech，Solna，Sweden）進行標記，并用OPTIR進行觀測β 折疊結構的分布。相比于傳統紅外很難定位的問題，FL-OPTIR通過寬場熒光能夠快速定位淀粉樣蛋白斑塊。并直接在腦組織中評估其在單個斑塊中的結構。通過 k 均值聚類方法對其進行分析，清楚地顯示了在 1630 cm^–1處具有高振幅和低振幅的兩組光譜的存在，并且具有 1630 cm^–1高振幅的光譜清楚地與熒光信號共定位。光譜分析表明 Amytracker 沒有對酰胺 I 和 II 區域有明顯的吸收，因此表明 Amytracker 可用于 OPTIR 測量的熒光引導。

圖 2. FL-OPTIR 對腦組織中的淀粉樣斑塊進行成像熒光和紅外圖譜和熱圖的展示。

在第二個實驗中，作者提供了一個概念性方法驗證實驗，證明 FL-OPTIR 可用于研究組織中的特定細胞類型，而這對傳統紅外顯微光譜法來說十分具有挑戰性。為此作者對腦組織中與淀粉樣斑塊相關的小膠質細胞進行成像，以評估它們的光譜特征，從而了解小膠質細胞是否可以將 Aβ 原纖維轉化為單體的問題。這個實驗使用 Aβ 特異性抗體 82E1 標記的 16 μm 組織切片，并用抗體 Iba1 對小膠質細胞進行了免疫標記。通過FL-OPTIR可以定位淀粉樣斑塊附近的小神經膠質細胞并測量 OPTIR 光譜。通過測量，發現 82E1 陽性小膠質細胞表現出β-折疊含量升高，表明小膠質細胞與 Aβ 原纖維相關。

圖 3. 腦組織中淀粉樣斑塊周圍小膠質細胞的成像。

在第三個實驗中，作者研究了 FL-OPTIR 在培養的原代神經元中 Aβ結構成像的適用性。與組織研究類似，淀粉樣蛋白的結構異質性使得研究神經毒性與 Aβ 結構之間的關系仍具有挑戰性。因此，為了直接評估神經元中的淀粉樣蛋白結構，作者使用FL-OPTIR技術基于熒光信號引導的光譜測量，發現遠端比近端神經突部分（分支后）相關的 Aβ 包含更多的 Aβ-聚集體, 作者認為這些神經元隔室可能本質上更容易結合 Aβ或者能夠主動運輸到遠端。

圖 4. 初級神經元中 Aβ (1–42) 的結構成像。

總結：

新型成像方法FL-OPTIR 結合了熒光成像和紅外光譜來描述生物組織內的結構變化。能夠針對復雜系統中的特定細胞、細胞器和分子進行分析和檢測，解決了生物標本中紅外光譜定位困難的問題。能夠直接在組織中定位和分析淀粉樣蛋白和相關的小膠質細胞，這可以解決局部環境在 AD 進展中的作用，幫助識別與淀粉樣斑塊相關的小膠質細胞，并在亞細胞水平上直接研究小膠質細胞中的纖維結構。為復雜樣品中的蛋白質和細胞進行紅外光譜分析提供了新的測量方法，為紅外在生物領域的應用提供更加便捷實驗途徑。

作為美國PSC公司在中國的代理，Quantum Design中國于2020年將非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統—mIRage系統引入國內，助力中國科研工作者取得一個又一個重大突破：

國內經典案例分享：

南京大學環境學院借助mIRage建立了一種新型的塑料表面亞微米尺度化學變化表征方法。該工作發表在期刊Nature Nanotechnology上。

中國農業大學借助mIRage成功實現對玉米粉中痕量微塑料的原位可視化表征。該工作發表在Science of the Total Environment上。

為滿足國內日益增長的生物紅外表征需求，更好的為國內科研工作者提供專業技術支持和服務，Quantum Design中國北京樣機實驗室引進了熒光引導光學光熱紅外顯微光譜，為您提供樣品測試、樣機體驗等機會，期待與您的合作！ 

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