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免疫濁度測(cè)定
閱讀：3630發(fā)布時(shí)間：2017-5-8
免疫濁度測(cè)定(immunoturbidimetry)是將現(xiàn)代光學(xué)測(cè)量?jī)x器與自動(dòng)化分析檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)，可對(duì)各種液體介質(zhì)中的微量抗原、抗體和藥物及其他小分子半抗原物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，在二者比例合適時(shí)，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度。1959年Schultze等根據(jù)抗原抗體結(jié)合后形成的復(fù)合物能引起液體介質(zhì)出現(xiàn)濁度改變的原理，建立了透射比濁法(turbidimetry)，形成的濁度使光線的透過(guò)量減少，則光線被吸收的量與免疫復(fù)合物(immune complex，IC)形成量呈正相關(guān)，從而根據(jù)所測(cè)吸光度值即可推算出待測(cè)抗原的量。1967年Ritchie等利用激光照射在液相中的IC微粒上時(shí)部分光線發(fā)生散射的原理，通過(guò)測(cè)量散射光的強(qiáng)度來(lái)求得待測(cè)抗原的量，這種比濁測(cè)定稱(chēng)為散射比濁法(nephelometry)。1977年Sternberg進(jìn)一步發(fā)展建立了速率散射比濁法(ratenephelometry)，成為目前定量測(cè)定微量抗原物質(zhì)并廣泛使用的一種高靈敏度、快速的自動(dòng)化免疫比濁測(cè)定法。免疫濁度測(cè)定可分為速率比濁法和終點(diǎn)比濁法兩種。
(一)免疫比濁測(cè)定的影響因素
1.抗原抗體的比例 抗原抗體的比例是濁度形成的關(guān)鍵因素，當(dāng)抗原和抗體的比例適當(dāng)時(shí)，二者全部結(jié)合，既無(wú)過(guò)剩的抗原，也無(wú)過(guò)剩的抗體，這時(shí)免疫復(fù)合物(1C)的形成和解離相等，其反應(yīng)式為：Ag+Ab—Ag·Ab。
當(dāng)抗原過(guò)量時(shí)，形成的IC分子小，而且會(huì)發(fā)生再解離，使?jié)岫确炊陆担馍⑸湟鄿p少，這就是高劑量鉤狀效應(yīng)(high does hook effect)。當(dāng)反應(yīng)液中抗體過(guò)量時(shí)，IC的形成隨著抗原遞增而增加，至抗原、抗體zui適比例處達(dá)zui高峰，這就是經(jīng)典的海德堡(Heidelberger)曲線理論。
因此，免疫比濁法的基本原理就是在反應(yīng)體系中保持抗體過(guò)量，如形成抗原過(guò)量則造成測(cè)定的準(zhǔn)確性降低。
2.抗體的質(zhì)量 免疫比濁測(cè)定法要求抗體的特異性強(qiáng)、效價(jià)高、親和力強(qiáng)，并使用R型抗體。
(1)抗體的特異性：抗血清zui核心的要求是單價(jià)特異性，即該抗體只針對(duì)某一種抗原，與其他無(wú)關(guān)抗原不發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性抗體和相應(yīng)抗原結(jié)合后形成的濁度代表真實(shí)的試驗(yàn)結(jié)果。
(2)抗體的效價(jià)：低效價(jià)(<1：20)抗體會(huì)增加非特異性濁度(偽濁度)的產(chǎn)生。
(3)抗體的親和力：親和力是指抗體和抗原結(jié)合的牢固程度。親和力強(qiáng)則抗體的活性高，不僅可以加快抗原抗體反應(yīng)的速度，而且形成的IC較牢固，不易發(fā)生解離，這在速率比濁法中尤為重要。
(4)R型和H型抗體：根據(jù)抗血清來(lái)源的動(dòng)物種類(lèi)不同，分為R型(rabbittype)抗體和H型(horsetype)抗體。R型抗體是指以家兔為代表的小型動(dòng)物被注射抗原免疫后制備的抗血清。這類(lèi)抗血清的特點(diǎn)是親和力較強(qiáng)，抗原抗體結(jié)合后不易發(fā)生解離，H型抗體是指以馬為代表的大型動(dòng)物注射抗原后制備的抗血清，這類(lèi)抗血清的親和力弱，抗原抗體結(jié)合后極易解離。
3.抗原抗體反應(yīng)的溶液 抗原抗體反應(yīng)液的zui適pH為6.5—8.5，超過(guò)此限度則不易形成IC，甚至可引起IC解離。在一定范圍內(nèi)，離子強(qiáng)度大，IC形成快;離子的種類(lèi)也可影響IC的形成，由慢到快依次為SCN—、ClO了、N03、Br—、Cl—、S(X—、H：P04和HPO擴(kuò)。因此，一般常使用磷酸鹽緩沖液作為免疫比濁法的反應(yīng)液。
4.增濁劑 某些非離子型親水劑對(duì)促進(jìn)IC的形成有顯著的增強(qiáng)作用，如聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)、吐溫-20(tween-20)，其作用是消除蛋白質(zhì)(抗原或抗體)分子周?chē)碾娮釉坪退瘜樱龠M(jìn)抗原、抗體分子靠近，結(jié)合形成大分子復(fù)
(二)免疫比濁方法分類(lèi)
1.透射免疫比濁法 通過(guò)檢測(cè)光被吸收、衍射、反射和折射后光線減弱的變化，來(lái)定量抗原抗體的復(fù)合物。
2.散射免疫比濁法 通過(guò)檢測(cè)光折射和衍射而形成的散射光強(qiáng)度來(lái)定量抗原抗體的復(fù)合物。該法根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的時(shí)間和反應(yīng)結(jié)合的動(dòng)力學(xué)，又可分為終點(diǎn)散射比濁法、固定時(shí)間散射比濁法和速率散射比濁法。
3.免疫膠乳比濁法 是以膠乳作為載體對(duì)小分子免疫復(fù)合物進(jìn)行微量測(cè)定，進(jìn)一步提高了免疫濁度測(cè)定的靈敏度。
(一)免疫比濁測(cè)定的影響因素
1.抗原抗體的比例 抗原抗體的比例是濁度形成的關(guān)鍵因素，當(dāng)抗原和抗體的比例適當(dāng)時(shí)，二者全部結(jié)合，既無(wú)過(guò)剩的抗原，也無(wú)過(guò)剩的抗體，這時(shí)免疫復(fù)合物(1C)的形成和解離相等，其反應(yīng)式為：Ag+Ab—Ag·Ab。
當(dāng)抗原過(guò)量時(shí)，形成的IC分子小，而且會(huì)發(fā)生再解離，使?jié)岫确炊陆担馍⑸湟鄿p少，這就是高劑量鉤狀效應(yīng)(high does hook effect)。當(dāng)反應(yīng)液中抗體過(guò)量時(shí)，IC的形成隨著抗原遞增而增加，至抗原、抗體zui適比例處達(dá)zui高峰，這就是經(jīng)典的海德堡(Heidelberger)曲線理論。
因此，免疫比濁法的基本原理就是在反應(yīng)體系中保持抗體過(guò)量，如形成抗原過(guò)量則造成測(cè)定的準(zhǔn)確性降低。
2.抗體的質(zhì)量 免疫比濁測(cè)定法要求抗體的特異性強(qiáng)、效價(jià)高、親和力強(qiáng)，并使用R型抗體。
(1)抗體的特異性：抗血清zui核心的要求是單價(jià)特異性，即該抗體只針對(duì)某一種抗原，與其他無(wú)關(guān)抗原不發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性抗體和相應(yīng)抗原結(jié)合后形成的濁度代表真實(shí)的試驗(yàn)結(jié)果。
(2)抗體的效價(jià)：低效價(jià)(<1：20)抗體會(huì)增加非特異性濁度(偽濁度)的產(chǎn)生。
(3)抗體的親和力：親和力是指抗體和抗原結(jié)合的牢固程度。親和力強(qiáng)則抗體的活性高，不僅可以加快抗原抗體反應(yīng)的速度，而且形成的IC較牢固，不易發(fā)生解離，這在速率比濁法中尤為重要。
(4)R型和H型抗體：根據(jù)抗血清來(lái)源的動(dòng)物種類(lèi)不同，分為R型(rabbittype)抗體和H型(horsetype)抗體。R型抗體是指以家兔為代表的小型動(dòng)物被注射抗原免疫后制備的抗血清。這類(lèi)抗血清的特點(diǎn)是親和力較強(qiáng)，抗原抗體結(jié)合后不易發(fā)生解離，H型抗體是指以馬為代表的大型動(dòng)物注射抗原后制備的抗血清，這類(lèi)抗血清的親和力弱，抗原抗體結(jié)合后極易解離。
3.抗原抗體反應(yīng)的溶液 抗原抗體反應(yīng)液的zui適pH為6.5—8.5，超過(guò)此限度則不易形成IC，甚至可引起IC解離。在一定范圍內(nèi)，離子強(qiáng)度大，IC形成快;離子的種類(lèi)也可影響IC的形成，由慢到快依次為SCN—、ClO了、N03、Br—、Cl—、S(X—、H：P04和HPO擴(kuò)。因此，一般常使用磷酸鹽緩沖液作為免疫比濁法的反應(yīng)液。
4.增濁劑 某些非離子型親水劑對(duì)促進(jìn)IC的形成有顯著的增強(qiáng)作用，如聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)、吐溫-20(tween-20)，其作用是消除蛋白質(zhì)(抗原或抗體)分子周?chē)碾娮釉坪退瘜樱龠M(jìn)抗原、抗體分子靠近，結(jié)合形成大分子復(fù)
(二)免疫比濁方法分類(lèi)
1.透射免疫比濁法 通過(guò)檢測(cè)光被吸收、衍射、反射和折射后光線減弱的變化，來(lái)定量抗原抗體的復(fù)合物。
2.散射免疫比濁法 通過(guò)檢測(cè)光折射和衍射而形成的散射光強(qiáng)度來(lái)定量抗原抗體的復(fù)合物。該法根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的時(shí)間和反應(yīng)結(jié)合的動(dòng)力學(xué)，又可分為終點(diǎn)散射比濁法、固定時(shí)間散射比濁法和速率散射比濁法。
3.免疫膠乳比濁法 是以膠乳作為載體對(duì)小分子免疫復(fù)合物進(jìn)行微量測(cè)定，進(jìn)一步提高了免疫濁度測(cè)定的靈敏度。
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