瓊脂糖膠和PAGE膠制備方法

一、瓊脂糖凝膠的特點
天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80％）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產生較強的電滲現象，加之硫酸根可與某些蛋白質作用而影響電泳速度及分離效果。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，其優點如下。
（1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進行電泳。
（2）瓊脂糖凝膠結構均勻，含水量大（約占98％~99％），近似自由電泳，樣品擴散較自由電流，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。
（3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。
（4）電泳后區帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。
目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學相結合，發展成免疫電泳技術，能鑒別其他方法不能鑒別的復雜體系，由于建立了超微量技術，0.1ug蛋白質就可檢出。
瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內切核酸酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便，設備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實驗方法之一。

二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據它們的相對分子量質量及分子構型，同時與凝膠的濃度也有密切關系。
1、核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關系
（1）DNA分子的大小 在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移率）與堿基對的對數成反比，因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。但是當DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。
（2）瓊脂脂糖的濃度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。

2、核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關系
不同構型DNA的移動速度次序為：供價閉環DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直線DNA>開環的雙鏈環狀DNA。當瓊脂糖濃度太高時，環狀DNA（一般為球形）不能進入膠中，相對遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長軸方向前進（Rm>0），由此可見，這三種構型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時，也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。
3、電泳方法
（1）凝膠類型
用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型（平板型）。水平型電泳時，凝膠板wan全浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是后者，因為它制膠和加樣比較方便，電泳槽簡單，易于制作，又可以根據需要制備不同規格的凝膠板，節約凝膠，因而較受歡迎。
（2）緩沖液系統
缺少離子時，電流太小，DNA遷移慢；相反，高離子強度的緩沖液由于電流太大會大量產熱，嚴重時，會造成膠熔化和DNA的變性。
常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TEA），Tris-硼/酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時稀釋到所需倍數。
TAE緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會出現沉淀，為避免此缺點，室溫下貯存5×溶液，用時稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩沖能力。
（3）凝膠的制備
以稀釋的電極緩沖液為溶劑，用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。
（4）樣品配制與加樣
DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內含有0.25％溴酚藍或其他指示染料，含有10％-15％蔗糖或5％~10％甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結果產生U形條帶，可改用2.5％Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。
（5）電泳
瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場強度增加時，較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率反而下降，為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場強度不宜高于5V/cm。
電泳系統的溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進行電泳，只有當凝膠濃度低于0.5％時，為增加凝膠硬度，可在4℃進行電泳。
（6）染色和拍照
常用熒光染料溴乙錠（EB）染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統輸出照片，并進行有關的數據分析。

SDS-PAGE膠制備

一. 實驗原理：
SDS-PAGE是對蛋白質進行量化，比較及特性鑒定的一種經濟、快速、而且可重復的方法。該法是依據混合蛋白的分子量不同來進行分離的。
SDS是一種去垢劑，可與蛋白質的疏水部分相結合，破壞其折疊結構，并使其廣泛存在于一個廣泛均一的溶液中。SDS蛋白質復合物的長度與其分子量成正比。在樣品介質和凝膠中加入強還原劑和去污劑后，電荷因素可被忽略。蛋白亞基的遷移率取決于亞基分子量。
二. 試劑和器材：
試劑：1. 5x樣品緩沖液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50％甘油，2ml 10％的SDS，0.5ml巰基乙醇，1ml 1％溴酚藍，0.9ml蒸餾水。可在4℃保存數周，或在－20℃保存數月。
2. 凝膠貯液：在通風櫥中，稱取丙烯酰胺30g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。過濾后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1個月。
3. pH8.9分離膠緩沖液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，調pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。
4. pH6.7濃縮膠緩沖液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，調pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙2胺）原液
6.10％過硫/酸銨（用重蒸水新鮮配制）
7. pH8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液：稱取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸餾水約900ml，調pH8.3后，用蒸餾水定容至1000ml。置4℃保存，臨用前稀釋10倍。
8. 考馬斯亮藍G250染色液：稱100mg考馬斯亮藍G250，溶于200ml蒸餾水中，慢慢加入7.5ml 70％的過/氯酸，最后補足水到250ml，攪拌1小時，小孔濾紙過濾。
器材：電泳儀，電泳槽，水浴鍋，搖床。

三. 實驗操作；
（一）樣品制備
將蛋白質樣品與5X樣品緩沖液（20ul＋5ul）在一個Eppendorf管中混合。放入100℃加熱5－10min，取上清點樣。
（二）分離膠及濃縮膠的制備1 將玻璃板、樣品梳、Spacer用洗滌劑洗凈，用ddH2O沖洗數次，再用乙醇擦拭，晾干；
2 將兩塊洗凈的玻璃板之間加入Spacer，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ說明書提示裝好玻璃板；
3 按如下體積配制10％分離膠8.0 ml，混勻；
ddH2O 3.0 ml
1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml
30％ Acr-Bis 2.8 ml
10％ SDS 80 ul
10％AP 56 ul
TEMED 6 ul
4 向玻璃板間灌制分離膠，立即覆一層重蒸水，大約20 min后膠即可聚合；
5 按如下體積配制6％濃縮膠3.0 ml，混勻；ddH2O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30％ Acr-Bis
2.0 ml 400 ul 600 ul
10％ SDS 10％ AP TEMED
36ul 24ul 4ul
6 將上層重蒸水傾去，濾紙吸干，灌制濃縮膠，插入樣品梳；
7 裝好電泳系統，加入電極緩沖液，上樣20 μl;
8 穩壓200V，溴酚藍剛跑出分離膠時，停止電泳，約需45 min～1hr.
9 卸下膠板，剝離膠放入染色液中，室溫染色1～2 hr；加入脫色液，置于80 rpm脫色搖床上,每20 min更換一次脫色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸餾水）至wan全脫凈。