活體細胞線粒體損傷/氧化熒光測定試劑盒產品說明書

YIJI 活體細胞線粒體損傷/氧化熒光測定試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI 活體細胞線粒體損傷/氧化熒光測定試劑是一種旨在通過特異性染色劑分析線粒體膜心磷脂的變

化來定性或定量測定線粒體內含質量以及自由基、氧化物等對細胞線粒體的毒性與損傷作用的而經典

的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老、

代謝和營養學等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩定。

技術背景

心磷脂（Cardiolipin）是線粒體膜上的主要成分之一。它對細胞氧化特別敏感。線粒體脂類分解，致使心磷

脂顯著減少，zui終造成線粒體的嚴重損害。Nonyl-Acrydine Orange（NAO）是一種可自由通過細胞膜的染

色劑，特異性地染色線粒體上的心磷脂，并發出熒光。一旦線粒體膜質量減少或受到損害以及被氧化，其

熒光顯著減弱。

產品內容

YIJI 清理液（Reagent A）        毫升

YIJI 染色液（Reagent B）       微升

YIJI 稀釋液（Reagent C）        毫升

YIJI 保存液（Reagent D）        毫升

產品說明書                     1份

保存方式

保存 YIJI 染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照，其余的保存在 4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（YJ12024）：用于細胞脫離*細胞培養液（YJ12052）：用于細胞操作所需的培養基

15 毫升錐形離心管：用于細胞操作的容器

1.5 毫升離心管：用于細胞染色的容器

血細胞計數儀：用于細胞計數

臺式離心機：用于沉淀細胞

細胞流式儀：用于細胞熒光分析

比色皿：用于細胞熒光分析的容器

熒光顯微鏡：用于觀察熒光細胞

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于細胞熒光定量分析

1

實驗步驟

一、 脫離或懸浮細胞分析

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 YIJI 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI

稀釋液（Reagent C）放進 37℃恒溫水槽里預熱。然后移出 xx 微升 YIJI 染色液（Reagent B）到新

的 1.5 毫升離心管，加入 xx 微升 YIJI 稀釋液（Reagent C），混勻后，將 YIJI 染色工作液置入

暗室里。同時開啟熒光顯微鏡或熒光光度儀。然后進行下列操作。

1． 準備 1 瓶 25cm2細胞培養瓶的待測細胞（約 1 X 106細胞）

2． 小心抽去細胞培養液

3． 加入 xx 毫升 YIJI 清理液（Reagent A）到細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面

4． 小心抽去 YIJI 清理液（Reagent A）

5． 加入 xx 毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養瓶表面

6． 置入 37℃培養箱 1 分種

7． 震動培養瓶，使細胞脫落

8． 加入 4 毫升用戶自備的*細胞培養液

9． 移入到 15 毫升錐形離心管，充分混勻（注意：懸浮細胞可以從這一步驟開始）

10．移取 10 微升在血細胞計數儀上進行細胞計數

11．移出 1 X 106細胞到新的 15 毫升錐形離心管

12．放進臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 300g

13．小心抽去上清液

14．加入 xx 毫升含有 YIJI 染色液（Reagent B）和 YIJI 稀釋液（Reagent C）的 YIJI 染

色工作液，輕柔混勻

15．放進 37℃恒溫水槽孵育 20 分鐘，避免光照

16．放進臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 300g

17．小心抽去上清液

18．加入預冷的 xx 微升 YIJI 保存液（Reagent D），輕柔混勻細胞顆粒群

19．放進冰槽里

20．即刻進行細胞流式儀分析（選擇下列其中一種）：

（A）波長 580nm（紅光），觀察 50000 個細胞以上

波峰左移，表明線粒體受到損害或被氧化，活性氧族含量高，脂類物質降解，線粒體質重降低（線粒

體損傷或氧化）

（B）波長 488nm（綠光），觀察 50000 個細胞以上

波峰左移或降低，表明線粒體受到損害或被氧化，活性氧族含量高，脂類物質降解，線粒體質重降低

（線粒體損傷或氧化）

21．或使用熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

1） 移出 50 微升在載玻片上

2） 即刻進行載玻片壓片（選擇下列其中一種）

（A）激發波長 580nm，散發波長 630nm

紅光減弱，表明活性氧族含量高，脂類物質降解，線粒體質重降低（線粒體損傷或氧化）

（B）激發波長 495nm，散發波長 519nm

綠光減弱或降低，表明活性氧族含量高，脂類物質降解，線粒體質重降低（線粒體損傷或氧化）

22．或使用熒光分光光度儀

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1） 移取 xx 微升染色后的細胞樣品到用戶自備的 1 毫升比色皿

2） 加入 xx 微升 YIJI 保存液（Reagent D）

3） 上下傾倒混勻

4） 即刻放進熒光分光光度儀測讀：濾波器激發波長 580nm，散發波長 630nm或濾波器激發波長 495nm，

散發波長 519nm：活性氧族含量高，脂類物質降解，線粒體質重降低（線粒體損傷或氧化）――相對

熒光單位（RFU）降低

二、貼壁細胞分析（熒光酶標儀法定量分析）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 YIJI 染色液（Reagent B）在室溫下融化，YIJI 稀

釋液（Reagent C）放進 37℃恒溫水槽里預熱。然后移出 xx 毫升 YIJI 稀釋液（Reagent C）到新的

15 毫升錐形離心管，加入 xx 微升 YIJI 染色液（Reagent B），混勻后，在室溫下靜置，并標記為

YIJI 染色工作液，放在暗室里。同時開啟熒光顯微鏡或熒光酶標儀。然后進行下列操作。

1． 從細胞培養箱里取出待測的 96 孔細胞培養板

2． 小心抽去每孔中的培養液

3． 小心加入 xx 微升 YIJI 清理液（Reagent A）到 96 孔板中每一個孔里

4． 小心抽去每孔中的 YIJI 清理液（Reagent A）（注意：確保培養孔中無任何液體殘留）

5． 小心加入 xx 微升含有 YIJI 染色液（Reagent B） YIJI稀釋液和（Reagent C） YIJI的

染色工作液到 96 孔板中每一個孔里

6． 放進 37℃培養箱里，孵育 20 分鐘

7． 小心抽去每孔中的 YIJI 染色工作液（注意：確保培養孔中無任何液體殘留）

8． 小心加入 xx 微升 YIJI 清理液（Reagent A）到 96 孔板中每一個孔里

9． 放進熒光酶標儀測讀：濾波器激發波長 580nm，散發波長 630nm，閃爍次數 10，間隔時間 0.5 秒

或濾波器激發波長 495nm，散發波長 519nm，閃爍次數 10，間隔時間 0.5 秒：活性氧族含量高，脂類

物質降解，線粒體質重降低（線粒體損傷或氧化）――相對熒光單位（RFU）降低

三、切片染色分析

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 YIJI 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI

稀釋液（Reagent C）放進 37℃恒溫水槽里預熱。然后移出 xx 微升 YIJI 染色液（Reagent B）到新

的 1.5 毫升離心管，加入 xx 微升 YIJI 稀釋液（Reagent C），混勻后，將 YIJI 染色工作液置入

暗室里。同時開啟熒光顯微鏡。然后進行下列操作。

1． 準備 1 個待測的切片樣品

2． 小心加上 xx 微升 YIJI 清理液（Reagent A），覆蓋切片表面

3． 小心移去切片上的 YIJI 清理液（Reagent A）

4． 小心加上 xx 微升含有 YIJI 染色液（Reagent B） YIJI 稀釋液和（Reagent C） YIJI的

染色工作液，覆蓋切片表面

5． 放進 37℃細胞培養箱里孵育 20 分鐘

6． 小心移去切片上的染色液

7． 小心加上 xx 微升新鮮的 YIJI 清理液（Reagent A）

8． 小心移去 YIJI 清理液（Reagent A）

9． 蓋上蓋玻片

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10．即刻在熒光顯微鏡下進行觀察：（選擇下列其中一種）

（A）激發波長 580nm，散發波長 630nm

紅光減弱，表明活性氧族含量高，脂類物質降解，線粒體質重降低（線粒體損傷或氧化）

（B）激發波長 495nm，散發波長 519nm

綠光減弱或降低，表明活性氧族含量高，脂類物質降解，線粒體質重降低（線粒體損傷或氧化）

注意事項

1． 本產品為 400 次（4 個 96 孔板）、200 次（200 個切片）或 20 次操作（1 毫升處理液）

2． 所有操作均須無菌狀態下進行

3． 操作時，須戴手套

4． 染色劑可以自由進入細胞

5． 孵育時，必須避免光照

6． 建議細胞染色完成后，即刻進行細胞流式儀分析

7． 紅光檢測具有特異性，而綠光檢測線粒體質量變化

8． 細胞流式儀分析細胞檢測量不得少于 10000 個

9． 如果出現紅光或綠光增強或右移，可能出現染料與胞漿內脂類物質非特異性結合，因此根據不同細胞

類型，調整 YIJI 染色工作液的使用劑量（1：100 至 1：1000 容量比），避免過度染色，干擾檢

測

10．本公司提供系列線粒體分析試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定熒光清晰