如何選擇高內涵儀器

 我們知道，過去十年，圖像獲取和分析的自動化為細胞生物學的發展鋪平了道路。一種更加可靠且高產的方法——高內涵分析（High Content Analysis，簡稱HCA）應運而生。

在這十幾年的發展過程中，市場上出現了很多高內涵儀器，這些儀器可以分為三大類：寬場熒光顯微鏡型高內涵、共聚焦熒光顯微鏡型高內涵和激光掃描型高內涵。

各種類型的高內涵儀器舉例

激光掃描型高內涵是以激光作為熒光光源，用PMT采集光信號，通過預設間距點掃描獲得數據，沒有成像的過程，速度快是其zui大的優勢。分辨率不高，只能提供虛擬圖像是這類儀器的局限性，X軸的分辨率是以預設的間隔（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5或5 um）設定的，而Y軸是用戶自行設定的，一般在1到10 um。由于不是基于圖像的分析，分析軟件相對簡單，適合于比較成熟簡單的細胞學實驗。所以被很多藥物研發企業作為初篩平臺。

基礎研究的實驗設計相對復雜，很多時候需要在亞細胞水平對細胞內的微細結構清晰成像，檢測的指標也復雜多樣，需要有非常強大的圖像分析軟件來設定，所以顯微鏡型的高內涵更適合科學研究的需要，藥物研發機構復雜的篩選實驗也會考慮使用顯微鏡型高內涵儀器。

如何選擇適合自己的高內涵儀器，主要考慮三個方面：

1、成像速度

高內涵儀器是在顯微鏡的基礎上搭建的高速顯微成像的平臺，從所得圖像中抽出一張和普通顯微鏡拍攝的圖像沒有區別，也就是說，寬場熒光顯微鏡型高內涵提供的是寬場熒光顯微圖像，共聚焦熒光顯微鏡型高內涵提供的是共聚焦質量的圖像。

高內涵儀器和普通顯微鏡zui本質的區別在于成像速度極大提高，如果每個孔取一個視野，雙色熒光，Hoechst染細胞核，EGFP標記細胞器，硬件自動聚焦，GE Healthcare的IN Cell 2000可以在約3分鐘內對整塊96孔板成像，在短短幾分鐘內得到將近200張照片。IN Cell 2000能夠高速成像是因為：1）明亮的光源，和顯微鏡以液體光導纖維相連，光的傳輸效率高，顯著縮短曝光時間；2）大芯片CCD相機可選擇，成像視野約是標準芯片相機成像視野的四倍，大芯片CCD相機一個視野就有可能捕捉到足夠的細胞用于統計學分析，節省很多時間；3）在線細胞計數功能：微孔板各個孔中細胞的生長狀態可能會不同，在線細胞計數針對不同的孔自動調整拍攝視野數量，整體縮短實驗時間；4）自動聚焦：是提高成像速度的關鍵，IN Cell 2000提供基于激光的硬件自動聚焦和基于圖像對比度的軟件自動聚焦，二者可結合使用。

需要注意的是，寬場熒光顯微鏡型高內涵比普通寬場熒光顯微鏡成像速度快，共聚焦型高內涵比共聚焦顯微鏡成像速度快，而共聚焦型高內涵未必比普通寬場熒光顯微鏡成像速度快，所以用戶需要根據實驗的需要來選擇適合自己的高內涵儀器。IN Cell 2000雖然不是共聚焦高內涵，但其*的去卷積圖像復原功能可以顯著提高圖像的對比度和分辨率，提供可以和共聚焦圖像媲美的高質量的圖像。

2、圖像質量和成像速度之間的平衡

科研用戶既希望成像速度快，又希望圖像質量好，可以考慮GE Healthcare的IN Cell 6000。它是以激光為光源的可變光闌線掃描共聚焦高內涵儀器，擁有的光學系統，成像*可調：光闌*打開時成像速度zui快，*共聚焦模式去除背景zui有效，光闌打開的程度在1-3 AU之間可調，可以針對不同的需求調節共聚焦程度達到成像速度和圖像質量的優化組合。IN Cell 6000感光成像采用550萬像素新一代sCMOS相機，噪音比CCD相機低五倍，超高靈敏度并縮短曝光時間，比標準相機的視野大四倍。

3、圖像分析軟件

科研用戶檢測的指標復雜多樣，除了基本的模塊式分析工具，還需要有更強大的分析軟件允許用戶自主定義分析程序。GE Healthcare的高內涵平臺除了基本的分析工具，還提供IN Cell Developer Toolbox 客戶自定義分析軟件，可以分析各種實驗的圖像結果。針對特定的實驗，用戶使用一系列的圖像分析工具來編寫自己的分析程序，包括：區分（segmentation）工具，圖像處理工具，自定義測量值，宏子程序等。Developer Toolbox曾獲得2006年*生物圖像分析軟件獎（美國科學雜志Scientific Computing頒發）。

Spotfire是一款用于科學數據分析的可視化分析平臺，其zui大的特點是通過多種動態的圖形（點圖、線圖、柱狀圖、餅狀圖、熱圖等）和篩選條件，快速對大量的數據進行分析和處理，并可以做出報告或與他人分享結果，做出決策。支持多種客戶端界面和Web界面的訪問和顯示。IN Cell 圖像分析軟件內嵌和Spotfire DecisionSite Basic軟件連接的圖標，輕松使用數據可視化分析工具。

IN Cell Miner HCM數據管理軟件以經過驗證的 EMC Documentum 軟件為基礎，可以方便地注釋、建檔、檢索、存儲高內涵圖像和數據。研究機構的所有使用者可以分享和比較數據，zui大限度地挖掘和實現這些數據的價值?？焖僦谱鼍赖臄祿D，用于工作展示、技術交流和文章發表。

IN Cell 2000和IN Cell 6000都可以對玻片成像，透射光成像有三種模式可選（明場、相差和微分干涉），可以提供溫度、濕度和CO2用于活細胞的長時間觀察，有自動移液加樣模塊用于動力學分析。

此外，IN Cell平臺du有的三種功能為高內涵實驗提供更多的幫助：1）預覽掃描功能：可以在任何放大倍數下對任意區域進行預覽掃描，幫助了解樣品概況，確定感興趣的區域和視野的分布，如果需要，可以對整個微孔板或者整張蓋玻片進行預覽掃描。2）整孔成像功能：低倍物鏡和大芯片CCD結合使用時，一張照片就可以快速捕捉整孔細胞、大面積組織和小生物體的圖像，在用高倍物鏡成像前可以快速確定感興趣區域的位置，也不會漏掉偶發事件。3）手動顯微鏡模式：當前視野全屏顯示，鼠標移動到四周可以顯示4組成像工具，分辨率更高，調整成像參數后，可以實時觀察效果。