基因轉移

基因轉移-介紹 
zui常用的將克隆重組的DNApian段導入哺乳動物細胞的方法是用磷酸鈣介導的轉染。轉染的DNA可能是通過吞飲作用進入細胞質，然后進行細胞核。

（1）配制下列溶液

①2×HEPES-緩沖鹽溶液（HBS）

②2mol/L CaCl2

③0.1×TE（pH8.0）用0.22μm濾器過濾除菌，分裝貯存于4℃。

④DNA：將DNA（約20μg/106細胞）溶于0.1×TE（pH8.0），使用濃度為40μg/ml。為使轉化效率達到zui高，質粒DNA應用CsCl-溴化乙錠密度梯度平衡離心法純化。如果所用DNA量較少，應加入載體DNA將DNA濃度調至40μg/ml。實驗室制備的真核載體DNA轉染效率通常要比商品化的牛胸腺DNA、鮭魚精DNA高。載體DNA用前應通過乙醇沉淀或氯仿抽提進行滅菌。

（2）轉染前24h用胰蛋白酶進行消化以獲得對數生長期的細胞，以1～2×105細胞/cm2的密度重新種入60mm組織培養皿中。在37℃、5%～7%CO2及一定濕度的培養箱中培養20～24h。

（3）每轉染一個60mm培養皿中的單層細胞，須依如下方法制備磷酸鈣-DNA共沉淀物：取步驟一所制備的DNA【40μg/ml，溶于0.1×TE（pH8.0）】220μl,2×HBs 250μl,放入一次性使用的滅菌5ml塑料管中，緩慢加入31μl 2mol/l 氯化鈣（溫和混合30s左右）。于室溫育20～30min，其間將形成細小沉淀。溫育結束時，用吸管將混合液吹打一次，使沉淀物懸浮。

通常采用的另一方案是將氯化鈣和DNA的稀釋混合液加入2×HBS溶液中，逐滴加入并小心混合250μl按步驟一制備并溶于氯化鈣（250mmol/L）的DNA。按照前述方法溫育之。

如果需要轉染更為大量的細胞，上述兩種反應混合液的體積均可翻一番或翻兩番。如果體積翻兩番，則須使用更大的塑料管，一般在25cm2細胞培養瓶或60mm細胞培養皿上，可將0.5ml磷酸鈣-DNA共沉淀物加入5ml培養液中，而在90mm細胞培養皿上，一般將1ml沉淀物加入10ml培養液中。

已經發表的方案中，混合各組分的方式與速率大不相同。其中有一些認為除了溫和振搖之外，其它措施均無濟于事，并建議用電動移液裝置吹出的空氣來混合溶液。其它一些方案則規勸在加入DNA溶液時連續而緩慢地混勻，然后再溫和振蕩。其目的是為了避免急速形成粗沉淀物，以致降低轉化效率。實際上，除了混合的速度之外，還有其它若干因素包括DNA的濃度和大小（讓高分子量DNA從細針頭中通過，可將之剪切變小）、緩沖液的pH（有些工作者配制了幾批pH范圍從6.95至7.1不等的HBS緩沖液，逐批試驗沉淀物的質量及轉染效率）。如果必須使轉染效率達到zui高，就要花時間針對特定的系統優化上述幾種因素。一旦得到一批靈驗的試劑，只需依照前面方法進行配制和貯存，即可在長期內獲得可重復的結果。

（4）將磷酸鈣-DNA懸液轉移至細胞單層上的培養液中【在60mm培養皿中，可將0.5ml懸液加入5ml培養液中】，輕輕左右晃動一下培養皿使培養液得以混合，此時可見培養液成黃橙色渾濁狀。另一方法是吸出培養液，直接把沉淀物加到細胞上，將細胞置于室溫溫育15min，然后再將培養液加回到培養皿中，此時細胞上有許多細小顆粒。采用以上兩種方法，都要在37℃、5%～7%CO2及一定濕度的培養箱中將轉染細胞培養長達24h【時間的長短取決于后續處理步驟的不同，見步驟（5）】。

（5）然后，轉染細胞可依以下任一種方法處理：

①如果不進行其它處理（如用氯喹、甘油或丁酸鈉等試劑處理，見后），可在細胞培養16～24h后，吸出培養液和沉淀物，用PBS將單層細胞再洗一次。然后按下述③d操作。

②在許多情況下，同時用氯喹處理細胞，可提高DNA攝入率。氯喹可能是通過抑制溶酶體水解酶類對DNA的降解而起作用的。氯喹濃度及其處理時間不能超越細胞對其毒性作用的耐受能力。因此必須通過預實驗來決定適于所用特定型別細胞的*氯喹濃度。但對于大部分型別的細胞，用終濃度為100μmol/L的氯喹處理3～5h，都可取得良好效果。可在磷酸鈣-DNA共沉淀物加入細胞之前或之后（見步驟（4）介紹的其它方法），直接將氯喹二磷酸貯存液（過濾除菌并貯于-20℃用金屬泊密封的管中，100mmol/L）稀釋（1：100）于培養液中。在氯喹處理過程中，細胞呈現泡狀是正常的。經用DNA和氯喹處理3～5h后，棄去培養液和沉淀，用PBS洗，然后按下述d操作。

③用甘油短暫處理細胞，同樣可提高轉化效率或導入DNA的瞬時表達水平。這一步驟可以在氯喹處理之后進行。由于不同細胞對甘油的毒性作用的敏感性相差懸殊，因此每種型別的細胞都必須通過預實驗決定*處理時間（從30s至3min）。耐受甘油的細胞可以暴露于含磷酸鈣-DNA共沉淀物（含或不含氯喹）的生長液3～5h后進行休克。

a. 吸出生長液，用PBS將單層細胞洗1次；

b.在單層細胞中加入1.5ml溶于1×HBS的15%甘油，在37℃培養0.5～3min；

c.吸出甘油，用PBS將單層細胞洗1次；

d.加入5ml預加溫的*生長液，放入培養箱中繼續培養24～60h后，檢測DNA的瞬時表達或將細胞重新種入適當的選擇性培養基中，分離穩定的轉化體。

④丁酸鈉也可以在猴源和人源細胞中增強帶SV40早期啟動子/增強子的重組質粒的表達。可直接在生長液中加入有關試劑，也可以使經過甘油休克的細胞接受丁酸鈉處理。須視細胞型別的不同，采用不同濃度的丁酸鈉（500mmol/L貯存液，在化學通風櫥中用NaOH中和丁酸制備而成），例如：

CV-1 10mmol/L

NIH-3T3 7mmol/L

HelaS3 5mmol/L

CHO 2mmol/L

不加*生長液，然后重復步驟d。

（6）轉移基因表達和細胞集落形成

①瞬時表達：在轉染后48～60h收獲細胞，進行RNA或DNA雜交分析。新合成的蛋白質可以用放射免疫測定Western印跡，體內代謝標記－免疫沉淀或者細胞提取液中酶活性的測定等方法來進行分析，如果測定中有重復品或者轉染細胞要經過多種不同條件或在一段時間歷程以內取不同時間進行處理，就要避免皿與培養皿之間轉染效率的偏差。在這些情況下，轉染大片的單層細胞（90mm培養皿），培養24h后用胰蛋白酶進行消化，再分接到若干較小的培養皿上。

②穩定轉化：在非選擇性培養基中培養18～24h，使所轉移基因得到表達之后，用胰蛋白酶消化細胞，種入適當的選擇性培養基中。這種培養基在2～3周內每2～4d須更換1次，以便除去死細胞殘骸并使抗性細胞集落得以生長。

可以克隆單個細胞集落，增殖后進行測定。可以用冰預冷的甲醇將仍保留在培養皿內的細胞固定15min，再于室溫用10%Giemsa染色15min，zui后用自來水沖洗，這樣即可得到細胞集落數的*記錄。Giemsa染液可用PBS或水現用現配，并用Whatman 1號濾紙過濾。

重新接種細胞以便取得分隔良好的細胞集落所要求稀釋倍數，主要由穩定轉化的效率來決定。這一效率可以相差若干個數量級，它起決于：a.受體細胞的型別（即使同一細胞系，克隆不同或傳代數不同，也表現出顯著差異）；b.導入基因的特性及其轉錄調控信號強弱；c.轉染中所用供體DNA的量。