對于許多適應(yīng)癥，細胞療法是一種越來越可行的治療選擇，尤其是對于已經(jīng)用盡傳統(tǒng)治療方法的患者。大量的臨床活動和幾種自體、患者特異性療法的批準增加了行業(yè)需求，也突顯了生產(chǎn)工作流程中的瓶頸。必須解決這些瓶頸，以提高生產(chǎn)效率、安全性以及及時向患者交付。

在自體環(huán)境中，每個患者的健康狀況和人口統(tǒng)計數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為一個細胞群體，這給隨后的細胞治療生產(chǎn)過程帶來了可變性。因為存在這種可變性，這意味著過程控制在確保藥品一致性方面的重要性。

一個重點領(lǐng)域是過程分析技術(shù)（PAT），這對于在整個生產(chǎn)過程和QC檢測中提供關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）信息至關(guān)重要。實時過程反饋對于加強過程監(jiān)控以確保生產(chǎn)成功至關(guān)重要，但關(guān)鍵過程反饋往往因檢測時間過長而延遲。

在最近的一次美國基因+細胞治療學會（ASGCT）在線會議上，Bristol Myers Squibb的Rich Rogers概述了基于質(zhì)譜的過程分析策略，以支持細胞治療過程的開發(fā)和優(yōu)化。Rogers概述了PAT的分析需求和儀器要求，以及基于MS的PAT如何有望成為一種強大的技術(shù)，以克服當前分析工具所面臨的許多挑戰(zhàn)。

CAR-T療法的屬性監(jiān)測

Rogers首先概述了BMS用于開發(fā)其基于自體慢病毒的CAR-T平臺的平臺。在生產(chǎn)自體CAR-T療法時，這一過程始于使用白血病細胞采集患者的細胞。一旦收獲了單核細胞，在細胞療法可以重新應(yīng)用到患者體內(nèi)之前，需要采取許多步驟來分離、激活、改造和擴增T細胞。目前，BMS使用PAT來監(jiān)測細胞增殖（即活率、細胞密度），并在每個階段使用流式細胞法來進行T細胞和雜質(zhì)分析（即污染細胞類型的存在）。雖然這些工具的數(shù)據(jù)是足夠的，但有機會對細胞健康和代謝狀態(tài)進行更深入的監(jiān)測還是有必要的，因為這很可能會影響最終產(chǎn)品的療效。

實施PAT的可能性是無限的，適用于生產(chǎn)過程的各個方面。PAT可用于確定工藝杠桿，以確保產(chǎn)品的一致性，并提高上游（即溫度、pH、葡萄糖、氨基酸、細胞活率和代謝物）和下游（即工藝相關(guān)雜質(zhì)）的生產(chǎn)成功率，以及量化最終產(chǎn)品中的CQA（即純度、效力、安全性和CAR頻率）。

Rogers概述了使儀器適用于過程PAT的一些關(guān)鍵功能：

•儀器占地面積：生產(chǎn)潔凈間通常空間有限，因此需要考慮儀器尺寸

•資本投資：與研發(fā)儀器不同的成本考慮

•生物測定的數(shù)量：可以進行多屬性測試的儀器

•低體積樣品要求：尤其是在生產(chǎn)過程中，通常無法采集大體積樣品進行過程中檢測

•運行分析的時間：從采樣到得到數(shù)據(jù)的時間應(yīng)該很快；檢測時間對于提供相關(guān)過程反饋至關(guān)重要

•技術(shù)專業(yè)知識要求低：操作過程中儀表所需的培訓應(yīng)較低，且無需專家參與

•數(shù)據(jù)速度：盡可能短/接近實時，對生產(chǎn)過程產(chǎn)生最大效益

基于質(zhì)譜的PAT策略

Rogers詳細介紹了BMS為過程分析開發(fā)的基于MS的非目標和目標PAT策略。MS是一種技術(shù)，用于在單克隆抗體等大分子治療中生成穩(wěn)健且可重復的數(shù)據(jù)。然而，將這一策略應(yīng)用于涉及數(shù)千種蛋白質(zhì)的細胞治療會帶來需要解決的障礙。一個障礙是作為CAR-T療法基礎(chǔ)的細胞的復雜性。大分子治療只需要純化單克隆抗體，而細胞治療可能需要考慮數(shù)千種蛋白質(zhì)。因此，傳統(tǒng)的大分子MAM（Multiple Attribute Methodology）方法不能直接應(yīng)用于細胞治療。

基于蛋白質(zhì)組學的PAT

Rogers還描述了BMS使用的基于MS的細胞表面蛋白質(zhì)組學方案，該方案在整個生產(chǎn)階段對T細胞進行非靶向細胞表面分析。細胞表面蛋白用生物素標記，然后進行細胞裂解、標記的鏈霉親和素富集、酶促消化和MS分析。

這種非靶向方法是有利的，因為它不需要特異性靶向細胞表面蛋白的試劑（與流式細胞法方法不同），這提供了T細胞表面蛋白組成的無偏見的全局視圖。

過程殘留和分泌蛋白監(jiān)測是另一個正在開發(fā)多屬性靶向蛋白質(zhì)組學方法來取代ELISA的領(lǐng)域，ELISA受到開發(fā)靶向特異性檢測試劑的需要的限制。這種MS方法是高度敏感的，因此允許同時對數(shù)百個蛋白質(zhì)靶標進行多重定量。從色譜分離、片段化和Orbitrap MS分析中選擇靶向肽，提供了過程殘留物和T細胞分泌蛋白的定量檢測。

在總結(jié)這些蛋白質(zhì)組學方法時，Rogers評論道，雖然他們對結(jié)果的準確性感到鼓舞，但這種方法仍需要努力，以滿足他在演講早些時候概述的PAT要求。MS儀器占地面積大，成本高，人員培訓廣泛，需要提高數(shù)據(jù)傳輸速度，以便在生產(chǎn)運行期間實時向?qū)嶒炄藛T提供及時的信息。

基于靶向代謝組學的PAT

在演講的后半部分，Rogers使用REBEL分析儀（908 Devices）專注于基于代謝組學的靶向PAT。該臺式設(shè)備通過采集來自生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基反應(yīng)液來對T細胞進行在線代謝分析。細胞分泌和代謝產(chǎn)物分析可以提供關(guān)于細胞健康和效力的有價值的信息。BMS計劃在過程開發(fā)的每個階段利用REBEL分析儀來實施代謝組學的研究。這包括慢病毒載體的組建以及T細胞增殖過程本身，其中REBEL分析儀已被用于提供關(guān)于T細胞健康和代謝狀態(tài)的有價值的信息。

REBEL分析儀滿足PAT的所有要求：

•占地面積小（微波爐大小），成本合理

•同時監(jiān)測30多種分析物

•只需要10μl樣品體積

•移液技能是技術(shù)要求

•所需培訓最少

•檢測時間快-大約~7分鐘/樣本

•快速獲取數(shù)據(jù)：集成軟件執(zhí)行分析并自動生成報告，該報告可以導出為與LIMS、PIMS兼容的CSV或PDF文件

在方法和儀器評估過程中，使用REBEL對同一生物反應(yīng)器運行的三個單獨樣品進行5次重復，以證明高重復再現(xiàn)性，如下圖1所示。

在結(jié)束演講時，Rogers強調(diào)了PAT對提高細胞療法的工藝理解和生產(chǎn)成功的重要性。對PAT和創(chuàng)新技術(shù)的投資正在推動當前方法的通量和準確性極限，Rogers表示，他認為基于MS的方法在靶向和非靶向蛋白質(zhì)組學和代謝組學表征方面都有很大的機會。在整個細胞治療制造過程中提供對T細胞的廣譜、全局評估。

在研討會的下一次演講中，908 Devices的產(chǎn)品經(jīng)理Kerin Gregory分享了如何使用REBEL分析儀通過對細胞培養(yǎng)基（即氨基酸、維生素、生物胺）的快速成分檢測來實現(xiàn)及時和有用的過程分析。細胞培養(yǎng)基為離體培養(yǎng)的細胞提供關(guān)鍵營養(yǎng)，并對細胞生長、生產(chǎn)力和后續(xù)治療的功能有直接影響。深入的培養(yǎng)基分析可以幫助深入了解營養(yǎng)的消耗，以促進培養(yǎng)基優(yōu)化工作，從而提高CQA。

營養(yǎng)成分分析和培養(yǎng)基優(yōu)化

特別是對于病毒載體的生產(chǎn)，滿足臨床和商業(yè)目標的需求需要提高病毒滴度。因為克隆差異會影響宿主細胞（即HEK293）的代謝，培養(yǎng)基/反應(yīng)液成分分析可以更好地了解宿主細胞的需求，并為優(yōu)化培養(yǎng)基以提高病毒滴度提供了機會。雖然市場上有許多商業(yè)培養(yǎng)基配方，但相對濃度和組成成分可能差異很大，如下圖2所示，這些不同的培養(yǎng)基選擇可能對病毒載體的滴度和完整性產(chǎn)生重要影響。REBEL也可用于監(jiān)測所選配方中的批次差異，以確保一致性和重復性。

此外，研究表明，T細胞培養(yǎng)基需要幾種關(guān)鍵氨基酸來調(diào)節(jié)體外激活和擴增，它們在CAR-T細胞的代謝準備狀態(tài)和引入體內(nèi)腫瘤微環(huán)境后的抗腫瘤功效中發(fā)揮作用。這強調(diào)了細胞培養(yǎng)基成分對細胞生長、代謝和生產(chǎn)力的深遠影響。

血清置換

Gregory補充道，由于兩個原因，細胞治療行業(yè)已經(jīng)從含血清的培養(yǎng)基配方轉(zhuǎn)向無血清：1）血清存在批次間的差異；2）除了在臨床應(yīng)用中的免疫原性風險之外，血清還具有潛在的被外來成分污染的風險。化學限定培養(yǎng)基（CDM）的開發(fā)代表了一個領(lǐng)域，在這個領(lǐng)域，REBEL可以用來表征成分，用于培養(yǎng)基的的配方工作。REBEL的動態(tài)范圍為5-100μM，可準確檢測低濃度的氨基酸和其他營養(yǎng)物質(zhì)。與其他定量方法不同，分析不受血清蛋白存在的影響。