高舒妤，朱國宴，郭國寧*

[摘 要] 目的 檢測外周血中可溶性B7-H3 在腦創(chuàng)傷合并骨折，單純骨折和單純腦損傷患者中的表達，并研究其對間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞的作用。方法  ELISA檢測可溶性B7-H3 及骨折愈合的標志物Cbfa1 在腦創(chuàng)傷合并骨折、單純骨折，單純腦創(chuàng)傷和正常志愿者外周血中的表達，茜素紅、real-time   PCR 檢測不同濃度重組B7-H3 蛋白對間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的作用。結(jié)果 可溶性B7-H3 在腦創(chuàng)傷合并骨折及單純腦創(chuàng)傷患者中的表達明顯高于單純骨折和正常人中的表達；可溶性B7-H3 在外周血中的含量與腦創(chuàng)傷嚴重程度相關(guān)；重組B7-H3 蛋白可促進間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化，并隨著質(zhì)量濃度的升高其促分化能力增強。結(jié)論 腦創(chuàng)傷導(dǎo)致的外周血中升高的可溶性B7-H3 促進了骨折愈合。

[關(guān)鍵詞] B7-H3；腦創(chuàng)傷合并骨折；骨折愈合；間充質(zhì)干細胞

[中圖分類號] R392.7 [文獻標識碼] A

骨折愈合是一個受到全身或局部多因素調(diào)控的、包括成骨細胞和破骨細胞參與的動態(tài)平衡過程[1]，其愈合速度受多種因素的影響。臨床發(fā)現(xiàn)顱腦損傷骨折愈合是一個受到全身或局部多因素調(diào)控的、包括成骨細胞和破骨細胞參與的動態(tài)平衡過程[1]，其愈合速度受多種因素的影響。臨床發(fā)現(xiàn)顱腦損傷發(fā)展相關(guān)。對于其非免疫功能，B7-H3 敲除鼠易發(fā)生骨折，而且 B7-H3 缺失的顱骨細胞成骨分化受阻，表明B7-H3 參與了成骨細胞的分化過程，采用特異性抗體4H7 刺激人間充質(zhì)干細胞膜上的B7-H3， 可直接促進其分化為成骨細胞[5-6]。

可溶性B7-H3（soluble B7-H3，sB7-H3）是膜結(jié)合型的可溶形式，可由單核細胞，樹突狀細胞，激活的T 細胞以及mB7-H3+的細胞釋放[7]，研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥患者或兒童肺炎患者中，血清中的sB7-H3 均表達升高，并與炎性因子的釋放呈正相關(guān)[8-9]。sB7-H3 與骨折愈合的研究未見報道。

間充質(zhì)干細胞屬于成體干細胞，在不同誘導(dǎo)條件下，具有向成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞等多種細胞分化的潛能，并且由于具來源廣泛、細胞增殖快、異體移植排斥反應(yīng)輕等優(yōu)點，在骨組織工程中備受重視，是形成成骨細胞的主要來源。

為研究sB7-H3 在腦創(chuàng)傷合并骨折愈合中的作用，我們對臨床腦創(chuàng)傷合并骨折與單純骨折患者及單純腦創(chuàng)傷患者sB7-H3 表達與骨折愈合的關(guān)系進行了探討，研究了體外加入重組B7-H3 蛋白對間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞的作用。

1資料與方法

1.1臨床資料 選取自 2014 年 2 月至 2016 年 11 月入住重慶西南醫(yī)院急救部的患者共56 例（男36 例， 女20 例），分別納入單獨腦創(chuàng)傷組（TBI）13 例，單獨骨折組（Fracture）20 例，腦創(chuàng)傷合并骨折組（TBI +fracture）23 例，骨折部位包括：股骨（femur）骨折14 例， 脛腓骨（tibia and fibula）骨折 11 例，肱骨（humerus） 骨折 10 例，尺撓骨（ulna and radius）骨折 8 例，另選擇健康體檢志愿者10 例為對照組。入院時有腦創(chuàng)傷的患者按GCS 評分分級：GCS>12 為輕度（Mild）腦創(chuàng)傷（6 例），9≤GCS≤12 為中度（Moderate）（9 例），3≤GCS≤8 為重度（Severe）（8 例），所有病例均排除傷前神經(jīng)病理或與骨相關(guān)的疾病，類風濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病及采用類固醇或雙膦酸治療的疾病。本研究經(jīng)lu軍軍醫(yī)大學（第三軍醫(yī)大學）附屬醫(yī)院倫理委員會批準并獲得患者知情同意書。

1.2血清樣本的收集 所有患者均于入院后12 h 內(nèi)采血，正常志愿者清晨空腹采集外周靜脈血 3 ml，4 ℃冰箱放置過夜，3 500 g 離心10 min，吸出上層血清置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3ELISA 檢測 人 B7-H3 ELISA 試劑盒購自Ebioscience 公司，人Cbfa1 ELISA 試劑盒購自上海滬鼎生物科技有限公司。實驗操作按說明書進行。

1.4間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 培養(yǎng)人間充質(zhì)干細胞至第3 代，更換間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基為成骨細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基（賽業(yè)生物），并分別加入2 μg/ml 和5 μg/ml 的重組B7-H3 蛋白（R&D 公司），培養(yǎng) 14 d 后，茜素紅S 染色檢測成骨細胞礦化，在顯微鏡下任意選擇 5 個視野，進行細胞數(shù)統(tǒng)計；收獲細胞， real-time PCR檢測Cbfa1 的表達。

1.5RNA 提取和real-time PCR檢測 Trizol 法提取RNA，測定濃度及純度。人源 Cbfa1 基因的定量表達檢測基于 L40992 序列進行引物設(shè) 計（Primer Primie 5.0 軟件輔助），隨后BLAST 確認引物特異性， 預(yù)期產(chǎn)物長度132 bp，用GAPDH 作內(nèi)參，預(yù)期產(chǎn)物長度 197 bp，交由上海生工生物工程有限公司合成。取1 μg 總RNA，按照TOYOBO 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，進行 SYBR 摻入法半定量檢測Cbfa1 的相對表達量（2-△△CT 法），反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)，完成PCR 擴增。引物序列如下：Cbfa1 F:5′-CCGCCTC AGTGATTTAGGGC-3′，R：5′-GGGTCTGTAATCTGA CTCTGTCC-3′；GAPDH F：5′-GGAGCGAGATCCCTC CAAAAT-3′ ，R ：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATG

G-3′。

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