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免疫學細胞實驗，如此簡單！
陳老師最近不再只熱衷研究分子互作了。體外分子水平的研究要結合細胞學的體內研究，才能得到更全面更真實的認識。尤其是免疫學研究中的細胞學實驗，包括細胞形態(tài)，細胞功能，細胞間的相互作用等，更是被越發(fā)看重。傳統(tǒng)的方法，比如某個時間點對細胞固定染色通過顯微鏡拍照的方式觀察細胞的變化情況，或是用流式、ELISA、PCR等終點法實驗對細胞的免疫反應進行檢測，而且這還不是活細胞狀態(tài)。
如果能夠通過實時動力學反映出活細胞的狀態(tài)隨時間的變化，豈不是更好？
這不，陳老師最近好好地研究了一番賽多利斯生物分析的三劍客之一——Incucyte®實時活細胞分析系統(tǒng)，直接把設備置于細胞培養(yǎng)箱內，不需要拿出培養(yǎng)箱觀察，即可對活細胞的行為進行實時、動態(tài)、連續(xù)地監(jiān)測，可長達數周，即可得到生長曲線/IC50/EC50，又可生成圖片及視頻。這可太適合免疫學相關的細胞學實驗了。
免疫學研究中常見的細胞實驗：
基礎研究：細胞增殖、免疫分型、免疫細胞激活與分化、細胞健康與凋亡等
細胞功能：免疫細胞殺傷、吞噬與清除作用、NETosis等
藥效評價：趨化/遷移、抗體內化、病毒感染等
有了Incucyte®實時活細胞分析系統(tǒng)，以上這些應用與分析都信手拈來。
今天陳老師就先給大家介紹其中的五個應用：
細胞增殖及計數
細胞鑒定和免疫分型
細胞激活和分化
細胞健康和凋亡
免疫細胞殺傷（細胞溶解）
01
細胞增殖及計數
相比傳統(tǒng)“終點法“，Incucyte®利用實時活細胞分析更高效地得到細胞增殖及計數結果（表1），并提供靈活、便捷的實驗方案（圖1）。既可以直接進行無標記的細胞匯合度分析，又可通過專業(yè)的Incucyte® Cell-by-Cell Analysis軟件進行無標記的細胞計數。通過面積尺寸、形狀及熒光強度等指標在單個細胞水平上對視野中的所有細胞進行自動分析和計算，得到生長曲線等數據結果。
終點法 | 實時活細胞技術 |
工作量及時間跨度大：24小時測定一次，每次實驗需要接種四塊板 | 置于培養(yǎng)箱中進行長時間監(jiān)測，通量高（可同時監(jiān)測6塊孔板） |
誤差較大，重復性較差，無法保證每個板或孔接種細胞均勻 | 鋪板后置入培養(yǎng)箱，無需移動細胞，保證精度和重復性 |
需要第三方軟件手動分析 | 軟件自動識別、分析，自動計算細胞數量、密度結果 |
表1. 終點法細胞增殖測定 vs 實時活細胞技術細胞增殖測定
|
無標記的細胞匯合度分析（confluence）：測量細胞生長曲線，追蹤變化趨勢 | 無標記的細胞計數：計算特定細胞數目，分析細胞亞群 | 熒光標記法計數細胞：使用非干擾型NucLight試劑對細胞核進行熒光標記，實時監(jiān)測細胞數目及增值 |
圖1. Incucyte®細胞增殖及計數分析
02
細胞鑒定和免疫分型
熒光標記的CD抗體（Abs）被廣泛用于流式細胞術進行細胞識別和免疫分型，至少有15種人類T細胞亞型被描述出來（例如，CD4+，CD8+等）。Incucyte®利用相同的原理，對標記方法進行改進：
將抗CD抗體結合到同型匹配的帶有熒光標簽的Fc區(qū)域靶向Fab片段，便可通過簡單的一步混合來完成標記。在檢測中使用一種非干擾性的背景熒光抑制染料，以改善488 nm的熒光信號，保護細胞的同時提供更靈活的分析方案。
03
細胞激活和分化
免疫細胞的分化和激活是免疫力和免疫應答的關鍵步驟。細胞通過受體信號傳導進行擴增并產生功能效應，最終導致基因表達、分化和表型變化。Incucyte®能夠更清晰、更深入地研究這個過程的復雜性和動態(tài)性：
a. 通過無標記或熒光標記，對免疫細胞活化的形態(tài)變化進行實時監(jiān)測；
b. 使用cell-by-cell軟件模塊對細胞的圖像分割，進行細胞分類；
c. 使用Cytolight Rapid試劑監(jiān)測活化T細胞聚團
04
細胞健康和凋亡
細胞健康和細胞凋亡的測量對于研究藥物、培養(yǎng)條件或基因改造對細胞生長或活力的影響至關重要。 Incucyte®通過使用專為活細胞分析而優(yōu)化的熒光染料，提供了一種非干擾的、“即混即讀"分析方式對細胞凋亡、細胞死亡的時間過程以及它們與細胞增殖的關系的洞察。
Caspase 3/7染料在存在活性caspase的作用下發(fā)出熒光，可檢測長期和短期效應；Annexin V染料與細胞膜外側的磷脂酰絲氨酸結合檢測早期凋亡，細胞非通透性的DNA結合熒光探針則可用于檢測細胞膜的完整性。該方法適用于貼壁細胞及非貼壁細胞，并且，無需將細胞從培養(yǎng)箱中取出即可分析細胞健康和活力，保護細胞、節(jié)約時間、提高質量。
05
免疫細胞殺傷（細胞溶解）
細胞毒性T淋巴細胞（CTLs）、自然殺傷細胞（NK）和某些中性粒細胞能夠殺死被感染的或惡性細胞。對于細胞殺傷的檢測，可通過檢測垂死的目標細胞中的釋放的Cr-51和細胞酶（如LDH）等來實現。但這些傳統(tǒng)方法存在諸多弊端，例如放射性。而檢測技術的關鍵挑戰(zhàn)在于：
(1) 高背景信號；
(2) 難以辨別可能來自效應（殺傷）細胞的污染信號；
(3) 如何判定并測量殺傷終點。
Incucyte®巧妙解決了以上難題。無需取出細胞、無需同位素或抗體標記，免清洗。利用實時、連續(xù)的成像方式捕捉細胞隨時間的變化信息。其中可以用熒光蛋白（如RFP）標記目標細胞，當它們被裂解時，監(jiān)測熒光的損失。另外也可直接采用annexin V或caspase 3/7測量目標細胞的凋亡。這些方法對于表征檢查點抑制劑、CAR-T細胞、雙特異性抗體和其他基于免疫的療法的表型效應非常有用。
既能不受培養(yǎng)環(huán)境限制進行活細胞觀察，又能實時分析得到動力學變化過程，就這么簡單～陳老師今天先介紹到這里，還有5個應用，請看下回分解～