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一文讀懂如何用Octet做分子垂釣
分子垂釣是生命科學研究中的一種常用技術，其基本原理就是從一個分子庫（例如某個細胞裂解液）釣取可以與配體結合的受體分子。通常情況下，我們先將配體固定在固相中，然后讓其與細胞裂解液中的分子進行結合，最后將結合的受體洗脫并交由質譜（MS）進行鑒定。
基于生物層干涉技術（BLI）的Octet® 非標記分子互作系統能夠快速、全自動、多通道平行地測試濃度和動力學常數。Octet® 的光纖生物傳感器可以通過多種方法固化配體，這不僅可以提供減少非特異性的良好固相，而且可以與質譜（MS）進行搭配使用，形成BLI-MS聯用技術。
圖1. BLI-MS的實驗流程如下：
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將生物傳感器浸入緩沖液中進行平衡
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將配體（例如抗體）固定到傳感器上
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在用分析物基質平衡后，將加載配體的生物傳感器浸入分析物溶液中進行結合
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經過短暫洗滌后，將捕獲的分析物在低pH溶液中洗脫
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重復進行結合和洗脫步驟，在同一孔洗脫液洗脫并富集受體
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通過LC-MS/MS消化和分析蛋白質，從而鑒定分析物
BLI-MS技術的可行性需要解答以下幾個問題：
Q
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需要多少量的目標蛋白才能進行有效的垂釣？
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釣出的背景蛋白數量是多少？
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是否可以觀察到垂釣步驟的BLI信號？
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如果一次垂釣洗脫量不足，需要重復垂釣幾次？
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這個過程的成本是多少？操作是否復雜？
接下來，我們就根據一篇相關文章[1]，和大家一起探討BLI做垂釣的可行性。
圖2. 垂釣方法開發思路：先從純蛋白垂釣鑒定蛋白量下限，再檢測高豐度和低豐度蛋白垂釣可行性
BLI-MS可捕獲和鑒定重組GFP
將GFP抗體固化在鏈霉親和素（SA）傳感器上，并讓其與純的GFP進行結合。通過LC-MS/MS方法對洗脫液進行鑒定，可以確認GFP已被成功捕獲并從生物傳感器中洗脫出來。GFP的MS信號強度與所用GFP的濃度成比例增加，檢測閾值為0.63 nM，這意味著僅需3.38 ng的GFP就可以被垂釣和鑒定出來。這個實驗結果驗證了Octet® 進行垂釣的可行性。
圖3. 左上圖：LC-MS /MS分析后，各濃度生物傳感器洗脫液中的GFP蛋白MS1強度；
右上圖：對數MS信號強度和濃度曲線圖；
下圖：使用Skyline提取的一種GFP肽（FEGDTLVNR）的離子色譜提取（XIC）信號
BLI-MS可以捕獲和鑒定細胞裂解物中帶有GFP標簽的蛋白質
為了在復雜的生物樣品中測試BLI-MS方案，該研究使用Octet® 從表達融合蛋白胱氨酸素-GFP的小鼠成纖維細胞的細胞裂解物中垂釣GFP標記的蛋白質。使用固化GFP抗體的傳感器，垂釣總蛋白100 μg、10 μg和 1 μg的裂解物，分別用30 個和 10 個結合/洗脫循環。文章設置了兩個陰性對照：
i 固化非相關 IgG 的生物傳感器，從表達融合蛋白的細胞中捕獲細胞裂解物
ii 使用裝載有GFP抗體的生物傳感器，從轉染EV（Empty Vector）的細胞中捕獲細胞裂解物（不含GFP）
在 100 μg ，10 μg裂解物的 BLI-MS 實驗中，我們觀察到了明顯的GFP融合蛋白的BLI信號，而兩個陰性對照沒有，這說明有GFP蛋白已被成功垂釣出來。經過LC-MS/MS分析，我們在所有陽性樣品中都檢測到GFP，而兩個陰性對照則沒有，這進一步說明了Octet® 做為一種垂釣方法的良好特異性。隨著循環數的增加和總蛋白量的增多，GFP信號增強，但同時背景蛋白數量也會增多。綜合考慮，可以選擇300 μg總蛋白量和10個循環的富集（耗費約1個小時）。
圖4. 使用Octet®從總細胞裂解物中分離GFP融合蛋白結果
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Octet®傳感圖顯示：含有總蛋白100 μg（A）、10 μg（B）和1μg（C）成纖維細胞裂解物中，實時鑒定垂釣GFP 融合蛋白的情況
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直方圖顯示：在進行1個和30個循環（D、E、F）后，對洗脫液進行LC-MS/MS分析后GFP的MS1強度
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堆積面積圖顯示：100 個和 10 個循環后從總蛋白1 μg（G）、30 μg（H）和 10 μg（I） 成纖維細胞裂解物中鑒定出的背景蛋白數量
BLI-MS可從脾細胞裂解物中捕獲和鑒定內源性CD16a
為了測試BLI-MS在復雜生物樣品中捕獲和鑒定內源性蛋白質性能，研究嘗試從300 μg人脾細胞裂解物中垂釣CD16a。陰性對照是固化無關 IgG 的生物傳感器。實驗重復三次。
在三次實驗中，CD16a抗體包被的生物傳感器上均有明顯的BLI信號，說明有物質被釣出。經過LC-MS/MS分析，可以在陽性樣品中檢測到CD16a，而三份陰性樣品中未檢測到CD16a。相對于高豐度樣品，雖然組織裂解物的蛋白背景更多，但是扣除陰性對照的蛋白后，陽性樣品可以鑒定出10種特異結合的蛋白質，其中CD16a豐度最高，進一步說明了Octet® 用于垂釣的高度特異性。
圖5. 兩份陽性樣品的BLI結合圖：紅色為對照（固化無關IgG對照），綠色為陽性樣品（固化CD16抗體）
表1. 列出了固化CD16a抗體的生物傳感器樣品中專門鑒定的 10 種蛋白質（含每個樣品的肽、總強度和種質名稱）
通過本文的實驗，我們得出
Octet® 做分子垂釣的如下結論：
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BLI-MS垂釣是完全可以行的
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對于高豐度和強結合受體，只需3-5個循環，且上樣蛋白總量可以較低
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豐度低內源性蛋白垂釣也沒問題，總蛋白量和循環數需要多一點,比如300 μg和30個循環
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時間為1-3小時（10-30循環），并且可以全自動化進行
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通常只需一根陰性對照傳感器和一根樣品垂釣傳感器，耗材成本低于200元
與傳統方法相比，使用
Octet®進行垂釣的優勢在于：
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提供多種傳感器固化已知分子，并且盡可能減少非特異性吸附
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通過垂釣的BLI信號，可以判斷是否有物質釣出
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可以自動化多次循環，在同一個孔里富集洗脫樣品
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將垂釣后的物質可以進行純化，由于采用非標記實時技術，可以更可信的測定受體與配體的親和力
小伙伴們，立即利用你們手中的Octet® 的垂釣功能去發現新大陸吧！
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-參考文獻-
[1] BLI-MS: Combining biolayer interferometry and massspectrometry. Proteomics 2022, 22:2100031