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超強(qiáng)CP，打開新型細(xì)胞療法新格局
細(xì)胞治療為疾病治愈提供了新的方法，給患者帶來新的希望。然而，由于缺乏高度癌癥特異性的表面標(biāo)記物，細(xì)胞治療在免疫治療靶點的選擇上面臨挑戰(zhàn)，并且在應(yīng)用上有一定的局限性。首先，由于正常細(xì)胞也表達(dá)靶點，使得治療中表現(xiàn)出顯著毒性。其次，大多數(shù)與實體腫瘤相關(guān)的抗原屬于胞內(nèi)蛋白，很難被識別，所以對于大多數(shù)實體瘤，細(xì)胞治療仍顯得力不從心。
今天，陳老濕為大家推薦幾篇近期發(fā)表的細(xì)胞治療相關(guān)文章，這些研究在一定程度上提出了解決上述問題的方法。當(dāng)然，這些文章均在研究過程中使用了賽多利斯的Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)和Incucyte® 實時活細(xì)胞分析系統(tǒng)，讓我們一起來看看吧。
Octet®
Incucyte®
Nature Cancer
嶄新的方法發(fā)現(xiàn)更特異的腫瘤標(biāo)志物！[1]
研究人員在美國加州大學(xué)舊金山分校開發(fā)了一種新方法，他們首先使用化學(xué)交聯(lián)劑將細(xì)胞表面的蛋白連接在一起，這一步驟可以在原位“凍結(jié)”蛋白質(zhì)的自然構(gòu)象，并保留其相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息。然后，他們對這些蛋白進(jìn)行糖蛋白氧化和生物素化處理，由于生物素與鏈霉親和素有很強(qiáng)的結(jié)合能力，利用這種蛋白富集方法，研究人員成功地增加了對腫瘤相關(guān)肽的質(zhì)譜覆蓋。這項研究發(fā)現(xiàn)，整合素β2的活化構(gòu)象是急性白血病的一個標(biāo)志物（圖1）。
圖1. 活性腫瘤表面抗原構(gòu)象篩選策略
研究人員利用基于完全人類框架序列的抗原結(jié)合片段（Fab）噬菌體展示平臺，對重組整合素β2抗體進(jìn)行篩選（圖2）。他們從約1010個候選結(jié)合物庫中，確定了10個與整合素β2有結(jié)合作用的候選物（Hit），其中5個通過基于生物層干涉技術(shù)（BLI）的Octet® 進(jìn)行驗證，確定能與活性整合素β2結(jié)合，其中編號7065#Hit最強(qiáng)。
圖2.展示篩選與活性整合素β結(jié)合的Fab片段：左圖為嵌合抗原受體（CAR）篩選過程；右圖為Octet® 檢測的親和力結(jié)果
基于7065#抗體，研究人員篩選設(shè)計CAR-T細(xì)胞，并使用Incucyte® 評估了對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性和T細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示，針對活性整合素β2（aITGB2）的CAR-T細(xì)胞在殺傷活性上優(yōu)于傳統(tǒng)的針對CD33的CAR-T細(xì)胞，同時也保持了T細(xì)胞的增殖活性。
圖3. Nomo1細(xì)胞被標(biāo)記mCherry，而CAR-T細(xì)胞則被標(biāo)記GFP，y軸代表通過熒光強(qiáng)度檢測細(xì)胞增殖的情況（mCherry上圖，GFP下圖）；在1:1的效應(yīng)-腫瘤（E:T）比例下，aITGB2 CAR-T細(xì)胞毒性水平與cd33 CAR-T細(xì)胞相似（左上）；在1:10的E:T比例下，aITGB2 CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)優(yōu)于抗cd33（右上）；兩種CAR-T細(xì)胞在共培養(yǎng)實驗中表現(xiàn)出相似的增殖（下面兩幅圖）；使用Incucyte® 實時活細(xì)胞分析系統(tǒng)，每4個小時自動拍攝一次，并計算mCherry和GFP熒光
本文驗證了一種潛在的系統(tǒng)性方法來識別和靶向癌癥中的構(gòu)象特異性抗原，基于活化整合素的CarT療法，值得在AML中進(jìn)行進(jìn)一步的臨床前評估，并為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向免疫治療靶點的其他應(yīng)用提供了途徑。
Nature
新型針對實體瘤的細(xì)胞治療法[2]
實體腫瘤靶點蛋白的降解片段，可以通過主要組織相容性復(fù)合體（MHC） 呈遞到腫瘤細(xì)胞表面，并被免疫系統(tǒng)識別，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。美國費(fèi)城兒童醫(yī)院的研究人員非常巧妙地選擇了很難通過蛋白突變找到治療靶點的神經(jīng)母細(xì)胞瘤作為研究對象，篩選出了特異存在于腫瘤細(xì)胞表面的多肽。以這些多肽為靶點，他們開發(fā)了一種新型的嵌合抗原受體CAR-T治療，并命名：PC-CAR（“Peptide-centric” Chimeric Antigen Receptors，多肽中心嵌合抗原受體）。將MHC分子結(jié)合的多肽通過類似Pull-down的方法富集，然后用質(zhì)譜的方法進(jìn)行鑒定，然后通過大型基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析對比和親和力預(yù)測，研究人員確定了一種未突變的神經(jīng)母細(xì)胞瘤肽，它源自PHOX2B（一種神經(jīng)母細(xì)胞瘤依賴性基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）。以這個多肽為靶點，使用噬菌體展示的方法篩選出了特異性的ScFv作為CAR，名字為10LH，使用Octet®測得其與PHOX2B親和力為13nM。
圖4. 左圖為PC-CAR示意圖，當(dāng)中紅色為呈遞的抗原；
右圖使用Octet® 固化10LH，與多肽進(jìn)行結(jié)合解離；kd=76×10−4/s，KD=13 nM，而另外一種ScFv 302LH的解離速率較快，親和力較低
接下來就是以免疫細(xì)胞殺傷為主的功能實驗，而在這篇文章中這個實驗的主力就是Incucyte® 實時活細(xì)胞分析系統(tǒng)。在殺傷實驗中，加入Caspase 3/7 紅色熒光染料，靶點細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）帶GFP綠色熒光，使用Incucyte® 實時計算紅色熒光面積和綠色熒光面積。紅色熒光面積升高快，綠色熒光下降快，則代表殺傷效果越大。
圖5. Incucyte® 實時活細(xì)胞成像：a左圖為PC-CAR對SKNAS膠質(zhì)瘤細(xì)胞（呈遞PHOX2B）的殺傷作用明顯，a右圖為PC-CAR對其他腫瘤細(xì)胞（不呈遞PHOX2B）的殺傷則不明顯；b圖從靶細(xì)胞動態(tài)增殖水平來觀察，發(fā)現(xiàn)PC-CAR對SKNAS等膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用明顯
J Immunother Cancer
CAR親和力并不是越高越好！[3]
大約50%接受抗CD19 CAR-T細(xì)胞治療的患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)，因此，迫切需要開發(fā)新的免疫治療靶點。最近有研究發(fā)現(xiàn)，CD72是B細(xì)胞惡性腫瘤中一個很有潛力的新靶點。之前發(fā)現(xiàn)的針對CD72的羊駝來源的納米抗體（NbD4）雖然有效，但是效果不及傳統(tǒng)的針對CD19的CarT。因此，以NbD4為母本進(jìn)行人源化，產(chǎn)生一系列新的CD72納米抗體。將這些納米抗體插入第二代 CD72 CAR-T 細(xì)胞中，并在體外和體內(nèi)針對 B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病和 B 細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的臨床前模型進(jìn)行評估。其中一種抗體克隆（H24）顯示出對B細(xì)胞腫瘤有著增強(qiáng)的殺傷效力，這也包括CD19 CAR-T復(fù)發(fā)后的患者來源樣本。H24 對 CD72 的結(jié)合親和力適中，而進(jìn)一步的提高親和力（KD<1nM）卻不會導(dǎo)致細(xì)胞毒性的增強(qiáng)。
圖6. Octet® 結(jié)果顯示：H24親和力高于母本NbD4，主要是解離速率常數(shù)Koff變小
圖7. Incucyte® 結(jié)果顯示，H24在增加腫瘤細(xì)胞殺傷的同時（左圖），保持了T細(xì)胞的增殖活性（右圖）
圖8. 對H24進(jìn)行親和力成熟并提高親和力的抗體NbD4.7,NbD4.13（左圖），并沒有增加對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性
為什么細(xì)胞治療研究要用
Incucyte® 實時活細(xì)胞分析系統(tǒng)呢？
培養(yǎng)箱內(nèi)可長達(dá)數(shù)周的連續(xù)觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過多操作對細(xì)胞的傷害；只要放好您的細(xì)胞，其他交給Incucyte® 吧
6個板位，分別獨(dú)立設(shè)置檢測程序，可以兼容各種孔板和培養(yǎng)皿，通量高
高效簡便的模塊化軟件設(shè)置和數(shù)據(jù)分析，輸出圖片、視頻、生長曲線等多指標(biāo)多參數(shù)；本文提到了使用Incucyte® 多個參數(shù)的監(jiān)控，使得結(jié)果更加準(zhǔn)確
大于100種優(yōu)化過的活細(xì)胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol，文章數(shù)大于12,000篇
為什么要用Octet® 呢？
非標(biāo)記Direct Binding是趨勢，不需要標(biāo)記和信號放大，可以更好的保持反應(yīng)物的活性
快速測定親和力，提供結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)更加定量化地表征分子互作
無洗滌步驟，可測弱親和力（解離快）
寫入了美國藥典，文章>12000篇，認(rèn)可度廣
萬金油技術(shù)，可以用于檢測DNA，小分子，蛋白質(zhì)等各種生物分子
操作簡便，耗材及維護(hù)成本低
在賽多利斯的Octet® 分子互作分析系統(tǒng)和Incucyte® 實時活細(xì)胞成像這對CP的助力下，相信有更多的新型細(xì)胞治療法產(chǎn)生！
實時活細(xì)胞分析開啟免疫細(xì)胞殺傷實驗新格局
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-參考文獻(xiàn)-
[1] Mandal, K., Wicaksono, G., Yu, C. et al. Structural surfaceomics reveals an AML-specific conformation of integrin β2 as a CAR T cellular therapy target. Nat Cancer 4, 1592–1609 (2023).
[2] Yarmarkovich, M., Marshall, Q.F., Warrington, J.M. et al. Targeting of intracellular oncoproteins with peptide-centric CARs. Nature 623, 820–827 (2023).
[3] Temple WC, Nix MA, Naik A, et al. Framework humanization optimizes potency of anti-CD72 nanobody CAR-T cells for B-cell malignancies. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2023;11:e006985. doi:10.1136/jitc-2023-006985