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樣品分析每一步都關鍵！用數據告訴你，如何擺脫步步驚心
樣品分析如何做到不要步步驚心，只要步步為營？！讓小編用數據告訴你！
Q1 FASP（過濾輔助樣品制備，Filter-Aided Sample Preparation）技術進行蛋白分析前的濃縮、脫鹽或者去除未消解蛋白的回收率如何？
使用超濾管利用FASP技術對樣品進行脫鹽或者去除未消解蛋白的同時還能實現樣品的濃縮，因此比脫鹽柱更加的高效。同時超濾管的性價比更高，且可以同時處理幾十個樣品，因而廣泛受到青睞。那么使用超濾管的回收率如何？我們可以一起看一下劍橋大學的應用數據：
劍橋大學的科學家在進行胰島素A鏈肽段（MW 2.5kD）和降鈣素（MW 3,593 Da）研究時，采用Vivaspin® 500 3kD 的產品在13,000 rpm離心對它們進行濃縮。盡管兩種蛋白的分子量很小，但回收率分別達到了98%和99%1。
Q2 HPLC分析，要實現無雜峰、低吸附，應如何選擇針頭濾器來進行澄清過濾？
應選擇化學兼容性好的濾器，最好有HPLC Certificate。例如，Minisart® RC，它材質純凈，化學兼容性好，既能過濾水系樣品又能過濾有機系的樣品。
再讓我們一起通過實驗數據看看如何實現低吸附？
紅色熒光蛋白、阿達木和M12單抗、RuBisCO酶，這四種蛋白分子量相差較大，PI 介于6.6~8.4之間。吸附性研究實驗設計為：分別對四種蛋白的濃度、體積、離子強度設定不同的水平并通過四種不同材質的針頭濾器進行過濾，共120個測定，來考察吸附情況2。
表1：對比四種蛋白過濾后吸附情況
結果顯示：
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PES和CA材質的濾器對幾種蛋白的吸附很小，是非常適合過濾蛋白樣品的濾器；而尼龍和PVDF的對蛋白吸附較高
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不同材質的濾器對蛋白的吸附情況并未因蛋白不同而有明顯的不同
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不同pH主要通過影響蛋白的溶解度而影響其回收率
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實驗結果顯示：蛋白的吸附符合朗繆爾模型，回收率隨樣品量和濃度的增加而增加
Q3 濾膜過濾是否會向流動相中釋放浸出物？
我們選擇了孔徑為0.2μm的兩種不同的賽多利斯濾膜材料，再生纖維素（RC，18407，批號1704923）和聚酰胺（尼龍，PA）（25007，批號1852193）。將所選過濾膜裝配于玻璃過濾器上（全玻璃真空過濾夾具，16309），通過過濾不同類型的溶液，來測試其在洗脫液過濾方面的性能。將所過濾的溶液用作洗脫液，使用HPLC-UV/VIS（純水和NaH2PO4緩沖液）和LC-HRMS（乙腈）進行分析。此外，分析了純水經再生纖維素RC膜或聚酰胺膜過濾后的TOC。實驗對照為只經過夾具未放置濾膜的樣品3。
圖1：純水和NaH2PO4緩沖液UV/VIS色譜圖
結果顯示：
該色譜圖顯示了RC膜非常低的色譜背景和低水平的污染物含量。而通過PA膜過濾的NaH2PO4洗脫液在梯度分離開始時出現了一些峰，表明存在有機化合物，經鑒定，這些化合物為聚酰胺低聚物。
圖2：用高分辨率質譜法對兩種膜過濾所得的洗脫液進行對比分析
結果顯示：
過濾的洗脫液和對照品的質譜圖只有微小的差別。在ESI負電離模式下，兩種膜過濾液的譜圖相當，與對照品一樣低。這相當于常見溶劑背景信號。在ESI正電離模式下所得的乙腈濾液質譜顯示了PA膜的一些小信號，這些信號可能歸屬為聚酰胺低聚物。這個結果與該過濾膜材料的TOC和HPLC-UV/VIS結果一致。
表2：TOC-V CSH分析結果
結果顯示：
對照品及兩種濾液的TOC值均在≤200ppb（ng/mL）范圍內，說明其有機污染物含量水平非常低。通過PA膜過濾后的濾液的TOC值稍高，說明這些樣品中有機物的含量稍高。
基于這些結果，我們可以得出結論：再生纖維素濾膜是洗脫液過濾的優選，因為它的有機化合物釋放量極低，并且與大多數溶劑都能很好地兼容。再生纖維素濾膜和聚酰胺濾膜均適用于在液相色譜分析中對水或有機流動相進行過濾。只是建議在HPLC應用中使用聚酰胺膜時，洗脫梯度的起始有機溶劑濃度應設定的較高。
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-參考文獻-
1. Alan R. Johnson, Christine Turner
Anatomy Department, University of Cambridge, Downing Street, Cambridge, CB2 3DY. UK
Lab filtration Application note 2001
2.A. Croon, J. F. Buyel
Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Forckenbeckstraße 6, 52074 Aachen, Germany
How to Increase Recovery at Critical Protein Samples: Impact of Syringe Filter Membrane, Volume and pH
3.Klaus Schöne1, *, Stephanie Schweizer1, Tanja Verena Maier 2 ,*, Roberto Menzel 2
1. Sartorius Lab Instruments GmbH & Co.KG, Otto-Brenner-Str. 20, 37079 Göttingen, Germany
2. Sartorius Stedim Biotech GmbH, August-Spindler-Str. 11, 37079 Göttingen, Germany
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