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自動、定量、可視化？匯合度定量細胞增殖與毒性全攻略
細胞增殖是細胞數量隨時間增加的生物學過程，是正常組織發育、再生和更新的重要機制。增殖的異常可能造成惡變和癌癥病理。細胞毒性則指物質或環境變化對細胞健康的有害影響。細胞經毒性刺激處理后可能會損害代謝活性，抑制細胞生長，甚至通過復雜的生物學途徑（如細胞壞死或細胞凋亡）導致細胞死亡。在細胞密集堆積或形態發生顯著變化之前，細胞匯合度是評估細胞增殖和毒性的理想指標。
Incucyte® 實時活細胞分析系統能夠在培養箱內進行長時程的實時自動化的檢測，通過分析細胞圖像面積隨時間的變化（匯合度百分比），實現細胞增殖可視化和定量檢測，并分析細胞毒性。
圖1. 左上圖為原始圖片，左下圖為圈描的細胞（黃色），右圖為根據總細胞面積（confluency）繪制的生長曲線。
今天，陳老師將與大家分享幾篇精彩的研究，展示如何使用Incucyte® 進行抗增殖作用和細胞毒性評估。
針對藥物篩選的細胞增殖與毒性測試
威斯康星醫學院[1]
N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一種含硫醇基團的抗氧化劑，已被用作癌癥生物學和腫瘤免疫學中的抗氧化藥物。其作用歸因于硫醇基團在線粒體中的抗氧化和氧化還原信號轉導。然而NAC的生物利用率很低，需要高濃度才可以發揮功效。大量的體內外癌癥研究發現，將三己基膦（TPP+）通過烷基側鏈共軛到藥物上，會使其選擇性靶向癌細胞線粒體的作用顯著增強。為了確定線粒體靶向硫醇對癌細胞增殖的影響，本文作者通過連接含有TPP+分子的烷基側鏈，合成了線粒體靶向的Mito10-NAC及其甲基類似物（圖2）。
圖2. NAC，Mito10-NAC以及其甲基類似物結構圖。
隨后，作者使用Incucyte® 實時活細胞分析系統連續一周監測了以上6種硫醇分子對人胰腺癌（MiaPaCa-2）、人乳腺癌（MDAMB-231和MCF-7）、人非小細胞肺癌（A549）細胞系，以及作為對照的非惡性乳腺癌細胞系（MCF-10A）的細胞增殖影響。通過Incucyte® AI Confluence軟件，對捕獲的圖像進行自動化的匯合度增殖定量分析。
結果顯示，與非靶向母藥相比，線粒體靶向NAC的抗增殖能力顯著增強，且甲基化進一步提升了其抗增殖效果。NAC需要較高的濃度才能表現出一定的生物活性，但是會顯著地影響正常細胞增殖。相較之下，Mito10-NAC則不僅低濃度就具備更好的生物活性，而且還不影響正常細胞的增殖生長。
圖3. Incucyte® 軟件的自動匯合度定量分析結果：NAC, Mito10-NAC以及其甲基類似物對MiaPaCa-2增殖作用的影響。所示數據為平均值± SD, n = 4 。Bar值小，重復性良好。真實反映了不同藥物濃度下細胞匯合度隨時間的變化；曲線旁邊的高清細胞圖像為對照細胞系的匯合度達到90%時（黑色豎線對應的時間點）對應的MiaPaCa-2細胞圖像，黃色圈描展示了Incucyte® 對細胞外輪廓的準確識別，進而提供實時的匯合度定量分析。
Incucyte® 可自動計算IC50值[1]
基于Incucyte® 監測分析結果進一步計算不同細胞系的IC50值，結果顯示，與非靶向母藥相比，靶向線粒體的硫醇分子具有的癌細胞增殖抑制效力普遍增強100-500倍，Mito10-NAC高達1500-2400倍（圖4）。也同時反映Mito10-NAC及其甲基類似物的抗細胞增殖作用可能與NAC清除活性氧或活性氮的抗氧化機制并無關聯。
圖4. 線粒體靶向藥物和相應母體化合物對MiaPaCa-2的細胞增殖抑制作用比較。
用于最佳細胞接種密度篩選[2]
低級別漿液性癌 （LGSOC） 是一種罕見的上皮性卵巢癌。由于治療選擇有限，需要更有效的療法來治療復發性疾病。為了解決這個問題，在 12 種患者來源的 LGSOC 細胞系和 1 種正常卵巢細胞系中進行高通量藥物篩選工作。為了建立細胞系生長動力學和最佳接種密度，將細胞系接種黑色384孔板中，并放置過夜。在 Incucyte®中以8小時的間隔拍攝相差圖像（放大倍數10×），至少持續 168 小時，每 96 小時更換一次培養基。使用 Incucyte®評估細胞匯合度。選擇掃描后 72 小時達到 70-80% 匯合度所需的最低接種密度進行高通量藥物篩選。
圖5. 以每孔 250–4500 個細胞/孔接種細胞，每個接種密度測試一式四份孔。Bar值小，重復性良好。
長時間活細胞檢測以確定藥物耐藥性[3]
解旋酶WRN通過多次基因篩選被鑒定為具有微衛星不穩定性（MSI）癌細胞中的合成致死靶點。HRO761是一種有效的、選擇性的、變構的WRN小分子抑制劑， 而伊立替康是一種用于晚期大腸癌治療的拓撲異構酶抑制劑。研究表明，HRO761和伊立替康在低效濃度下的聯合使用，能顯著增強SW48細胞的抗增殖活性。在較高劑量的HRO761下，它能阻止體外細胞的長期再生（長達40天的跟蹤）。體內實驗也證實了HRO761和伊立替康聯合用藥的效果，使腫瘤完全消退。
圖6. Incucyte® 生成的匯合圖展示了長期暴露于指定濃度的HRO761和伊立替康（irinot.）組合的SW48細胞匯合情況，每7天換一次培養基；而在較高劑量的HRO761下，它阻止了體外細胞的長期再生。
使用Incucyte® 的關鍵優勢
培養箱內可長達數周的連續觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過多操作對細胞的傷害
Incucyte® AI Confluence軟件借助AI大數據驅動功能，對細胞邊界進行準確識別，自動定量細胞匯合度隨時間的變化，可以實現更直觀、更可靠的細胞增殖監測分析
多個板位，分別獨立設置檢測程序，可以兼容各種孔板和培養皿，通量高
具有劃痕、腫瘤球、類器官、趨化、血管生成等多個分析拍攝模塊，并配套相應的耗材
高效簡便的模塊化軟件設置和數據分析，輸出圖片、視頻、生長曲線等多指標多參數，使得結果更加準確
大于100種優化過的活細胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol
文章數>15,000篇，認可度廣
Incucyte®長時程活細胞成像系統應用文集
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為了將Incucyte®推廣到更多的活細胞實驗，我們致力于提供全面的應用解決方案。《Incucyte®長時程活細胞成像系統應用文集》除了基礎的細胞增殖和活性監測外（如細胞凋亡/周期/毒性等），還涵蓋了抗體內化、旁觀者效應、共培養殺傷、炎癥反應（NETosis）、細胞吞噬、劃痕實驗、細胞趨化、類器官研究、腫瘤球分析、神經突生長、ATP 檢測、線粒體膜電位、病毒/脂質體/外泌體監測、全孔成像等多個方面。應用范圍廣，是您尋找實驗方法的有利工具。
-參考文獻-
[1] Cheng, G., Hardy, M. & Kalyanaraman, B. Antiproliferative effects of mitochondria-targeted N-acetylcysteine and analogs in cancer cells. Sci Rep 13, 7254 (2023).
[2] High-throughput drug screening identifies novel therapeutics for Low Grade Serous Ovarian Carcinoma | Scientific Data (nature.com)
[3] Discovery of WRN inhibitor HRO761 with synthetic lethality in MSI cancers | Nature