Overview

生物污染控制策略是新標準和指導方針如EN17141及歐盟GMP附錄1的修訂版本的關鍵要求。歐盟和英國已采用了2020年發(fā)布的EN17141取代ISO14698。EN17141附錄E章節(jié)對基于培養(yǎng)技術的微生物監(jiān)測方法和取樣器驗證指南作了詳細的說明。

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本篇《根據EN17141和ISO14698，使用凝膠膜過濾器進行潔凈環(huán)境中的空氣監(jiān)測》應用說明重點關注活性微生物的監(jiān)測，并證明通過凝膠膜過濾技術進行的微生物空氣監(jiān)測符合EN17141和ISO14698的要求。

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簡介

無菌和生物制藥生產中必須實施生物污染控制策略。要實現這些控制，就需要精心設計工藝流程以免污染、實施監(jiān)測系統(tǒng)以監(jiān)測污染、以及實施補救策略以迅速解決污染事件。

空氣污染物可通過主動采樣進行測量，而主動采樣需要使用專業(yè)的設備主動抽取規(guī)定體積的空氣。這便于準確測量每立方米（m3）的空氣中的微生物菌落形成單位的數量（CFU）。

采樣器效率可分為物理效率和生物效率。物理效率是采樣器收集的微生物數量與取樣空氣體積中存在的總數量的比率。生物效率是從空氣樣本中回收的活性微生物數量與預期收集的數量的比率。

物理采樣效率

枯草桿菌黑色變種芽孢（1.2μm x 0.8μm）是一種能夠承受霧化壓力的強健微生物。

在受控環(huán)境室中使用旋轉頂部氣溶膠發(fā)生器生成含有不同大小的活枯草芽孢桿菌孢子顆粒的微生物氣溶膠。將含有 0 - 7 %（重量/體積百分比）碘化鉀（Kl）的 80%乙醇的孢子懸浮液（約 106CFU/ml）注入氣溶膠發(fā)生器中。顆粒的大小可通過旋轉頂部的速度和懸浮液中的KI濃度來調節(jié)。與氣溶膠發(fā)生器等距放置的采樣器可同時采集樣本。

截留率

通過使用霧化枯草芽孢桿菌孢子進行的細菌激發(fā)試驗（BCT）測定出了凝膠膜過濾器的截留率。在BC試驗中，使用了 1.2 * 105 CFU/cm2 枯草芽孢桿菌孢子來挑戰(zhàn)凝膠過濾器，然后檢測過濾后的空氣是否受到枯草芽孢桿菌的污染。凝膠過濾器對枯草芽孢桿菌孢子的最高截留率 > 97.996%（圖1）。

圖1：用 1.2 * 105 CFU/cm2的枯草芽孢桿菌孢子進行激發(fā)試驗后得出的凝膠膜過濾器截留率。

物理采樣效率

結果表明，0.8μm和 16μm之間顆粒的收集效率沒有顯著的差異（圖2）。

圖2：與Casella狹縫取樣器相比，凝膠膜過濾器在不同粒徑的 1.2 * 105CFU/cm2枯草芽孢桿菌孢子激發(fā)時的物理取樣效率。



生物采樣效率

試驗結果表明，凝膠膜過濾器可以可靠地收集空氣中的攜菌顆粒，且不會降低回收率。

通過從含有植物細菌的氣溶膠中取樣，并將其與實驗室自然空氣中的微生物回收率進行比較，測定出了凝膠過濾法的生物效率。

大腸桿菌和枯草芽孢桿菌

通過噴灑在環(huán)境室內生成含有枯草桿菌黑色變種孢子（1.2μm x 0.8μm）和革蘭氏陰性大腸桿菌（2μm x 1μm）混合物的氣溶膠。結果表明，與Casella狹縫取樣器相比，大腸桿菌與枯草芽孢桿菌孢子之間的比率沒有顯著差異（圖3）。這也證實，基于凝膠膜過濾的空氣采樣不會對植物微生物的生存能力產生不利的影響。

圖3.與Casella狹縫取樣器相比，凝膠膜過濾器的懸浮大腸桿菌/枯草芽孢桿菌孢子生物取樣效率。

連續(xù)微生物空氣監(jiān)測（8 h）

實驗證明，在從環(huán)境空氣中連續(xù)采樣 8 小時后，與對照組相比，平均CFU計數沒有顯著的變化。此外，與僅 30 分鐘的采樣周期相比，微生物范圍沒有顯著的變化（圖4和圖5）。

圖4.與取樣 30 分鐘后直接放置在營養(yǎng)培養(yǎng)基上的凝膠過濾器相比（參照），取樣（試驗）8 小時后凝膠膜過濾器上的微生物回收率。

圖5.在凝膠過濾器上取樣 8 h（A）后與取樣 30 min后直接放置在營養(yǎng)培養(yǎng)基上的凝膠過濾器（B）的回收菌種范圍比較。



凝膠過濾法的優(yōu)點

- 在特定時間內增加流速或延長采樣時間，可進行大容量采樣和/或長期采樣，并在 8 小時內連續(xù)收集空氣，而不會對微生物回收產生不利影響。

- 避免將營養(yǎng)培養(yǎng)基引入隔離器/灌裝線。

- 營養(yǎng)培養(yǎng)基不會因脫水而造成水分流失。

- 由于凝膠膜過濾器容易溶解在瓊脂表面，因此，可確保從孔結構中輕松回收微生物。

- 在典型工作班次 8 小時的取樣期間，可避免操作員干預（例如，頻繁更換培養(yǎng)基板）。

- 經證實的病毒截留率有助于監(jiān)測空氣中傳播的外來病毒。

- 使用凝膠膜過濾器和快速檢測法（PCR）。

空氣采樣器技術性能

MD8 Airscan® 經過專門的開發(fā)，主要用于潔凈室環(huán)境，不會干擾氣流模式。取樣頭可集成到關鍵控制點的隔離器、灌裝線或其他潔凈室環(huán)境中，并可進行等速取樣。取樣頭（整個氣流路徑）可以通過汽化/氣相過氧化氫（VHP）進行消毒。

采樣量可通過空氣流速來調節(jié)，并可通過集成式空氣流量計來持續(xù)監(jiān)控。凝膠膜過濾器具有多種配置，可滿足每一種微生物檢測需求。

MD8 Airscan®

Conclusion

實驗結果證明，與Casella采樣器相比，凝膠膜過濾器的截留率超過 97.996%，物理取樣效率超過 80%。在EN17141和ISO14698標準中，膜過濾法被認定為高效生物取樣的參考方法。盡管如此，我們還是將凝膠膜過濾法的生物效率與Casella取樣器的生物效率作了比較，并證明，與Casella取樣器相比，革蘭氏陰性大腸桿菌與枯草芽孢桿菌孢子的比率沒有差異。

即使經過 8 小時的采樣期，凝膠膜過濾法的高生物采樣效率仍保持不變。連續(xù)采樣也不會對過濾器的平均CFU計數以及回收的微生物種類范圍產生不利的影響。

結果表明，無需重新評價賽多利斯微生物空氣監(jiān)測儀器和耗材的功能，

并且凝膠膜過濾方法符合EN17141和ISO14698 的要求。該方法還符合歐盟GMP附錄1，2020年修訂版中關于活性顆粒環(huán)境監(jiān)測的規(guī)范。

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