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染色質生化研究進入條碼測序時代

點擊次數：934 發布時間：2014-9-10

帶“條形碼”的半合成核小體（nucleosome）搭配大規模平行測序技術（massively parallel sequencing），能夠為人類提供一個全新的技術平臺，用來分析染色質相關蛋白質（chromatin-associated proteins）的組蛋白識別（histone-recognition）及組蛋白修飾（histone-modifying）活性。

科學家過去一直認為組蛋白的功能非常簡單，只是在DNA的核內包裝過程中起到一個架的作用。但是現在他們已經逐漸認識到了組蛋白，以及組蛋白的各種翻譯后修飾作用（post-translational modifications， PTM）在DNA可接近性（DNA accessibility），以及基因組功能方面所具備的重要的動態調控功能。

在眾多作用機制當中，組蛋白的PTM可以通過招募各種效應蛋白（effector protein）來發揮調控作用，這些效應蛋白能夠解析在染色質上的各種組蛋白PTM狀態。

經過近20年的科學研究，科學家對這些PTM是如何產生、刪除，以及如何被解讀的機制的認識有了比較大的提升，但我們還是不太清楚這些PTM在核小體這種染色質基本結構單元中發揮的生化作用是如何被調控的。

不過z近在這方面取得了突破，Nguyen等人將天然化學連接重組核小體技術（native chemical ligation coupled with recombinant nucleosome technology）與高通量測序技術（high-throughput sequencing）這兩種在染色質生化研究工作中比較成熟的技術結合起來，開發出了一種功能強大，適用范圍有非常廣的新方法，利用各種打好條形碼的核小體文庫，就可以確定這些功能復雜的染色質條款因子了。

在發現組蛋白乙酰轉移酶（histone acetyltransferases）和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases）具備轉錄調控功能之后，科學家們又緊接著利用各種經過修飾的組蛋白多肽（modified histone peptides）開展了一系列對今后具有重大影響作用的結構研究和生化研究，發現bromodomain結構域就是一種能夠識別乙酰基—賴氨酸（acetyl-lysine）結構的基序，在這個確鑿證據的支持下，從而將組蛋白PTM與基因活性給了起來。

后來由于利用了固定組蛋白多肽（immobilized histone peptides）或各種已標記識別結構域（tagged putative reader domains）的高通量芯片篩查技術（high-throughput， microarray-based screening）有了進一步的發展，我們在發現PTM識別結構，以及PTM靶標結構等方面又取得了不錯的成果，發現了好些染色之效應子結構域，比如惡性腦腫瘤結構域（malignant brain tumor domain）、Tudor結構域和植物同源結構域（plant homeodomain）等。

雖然已經取得了這些不錯的成績，了解了一些效應蛋白與染色質的相互作用機制，但這主要反映的都是一個結構域與幾種修飾后的組蛋白多肽之間的相互作用。可是很多效應蛋白里都含有好幾個識別結構域，每一個核小體也都含有兩對核心組蛋白（即H2A、H2B、H3及H4組蛋白），有些核小體里還含有H2A.Z、H2A.X和H3.3等其他組蛋白，這些組蛋白在染色質里都有各自*的作用，我們對此還是知之甚少。核小體和效應蛋白的這種組織結構創造出了非常復雜的染色質識別體系。

比如，一個含有多個結合結構域的染色質效應蛋白就應該能夠異性地識別一個組蛋白上的多個不同的PTM，或者位于一個核小體、或者相鄰核小體上的多個不同組蛋白上的PTM。實際上，z近開展的一項研究使用半合成核小體也證實了，NURF染色質重構復合體中的BPTF亞基就能夠依靠其自身的bromodomain結構域和植物同源結構域，通過反式相互作用（trans interactions）分別識別H4K16ac和H3K4me3這兩種組蛋白PTM。這種依靠核小體的實驗技術也讓我們能夠在更加符合生理狀態的條件下，研究染色質效應蛋白與各種PTM之間的關系，但低通量是這種方法的缺陷，一次只能研究一個核小體因子。所以嚴重阻礙了染色質核小體研究工作的進展。

圖1 帶有各種已修飾組蛋白的DNL可以被用來驗證組蛋白PTM抗體的異性，研究帶有單個或多個識別結構域的核小體間的相互作用，以及驗證酶的組蛋白修飾活性。其基本作用原理都是對各種實驗富集的核小體上的DNA條形碼進行大規模平行測序。

Nguyen等人采用的則是一種現有技術的改進版，他們利用表達蛋白連接技術（expressed-protein ligation technology）快速地生成了規模龐大的半合成核小體文庫，這些半合成核小體的一個或者多個組蛋白上全都帶有一個或者多個非常明確的、已知的PTM。他們的創新之處就在于使用了帶有*條形碼標簽的DNA來合成人工核小體。

由這些核小體組成的DNA標記核小體文庫（DNA-barcoded nucleosome libraries， DNL）會被用于具有與染色質免疫沉淀（in vitro chromatin immunoprecipitation）體外實驗同樣靈敏度的競爭性生化反應（competitive in-solution biochemical assay），然后對實驗所得再進行高通量測序，即用于所謂的ChIP-seq實驗（圖1）。除了高通量確定組蛋白識別結構域和修飾因子的PTM異性這一個作用之外，DNL文庫技術還能夠對PTM異性抗體進行驗證。實際上，抗體的異性是染色質研究領域非常關注的一個問題，尤其在要求高性全基因組組蛋白PTM分析這個工作方面更是如此。

Nguyen等人使用這個技術平臺對BPTF和BRD4這兩種已經被研究得非常清楚的組蛋白識別結構域，以及p300這種組蛋白乙酰轉移酶進行了驗證性實驗。除了發現了這些因子之間的已知的相互作用之外，他們還發現組蛋白H4的多聚乙酰化作用（polyacetylation）在招募這些因子時也起到了非常重要的作用。尤其值得一提的是，p300與多聚乙酰化的H4蛋白之間的結合進一步促進了p300對組蛋白的乙酰化修飾作用，即起到了一個正反饋的作用。Nguyen等人還發現，在H3K4me3核小體中也存在這樣一個正反饋通路，這也就更進一步明確了反式組蛋白相互作用對p300這樣的染色質調控因子也產生了影響。

在染色質研究工作中，建立DNL文庫是一項重大的進步，很有可能會在不久的未來帶來突破性的進展。雖然Nguyen等人的工作已經非常清楚地證實了該技術的強大優勢，但是半合成核小體構建工作還是存在一些技術上的難點，需要對有機化學實驗技術和生物化學實驗技術相當熟練的人才能夠勝任。所以這項技術是否能夠得到廣泛推廣，我們還需要拭目以待。

除此之外，這種半定量式的方法可能也不太適合解析復雜的相互作用，比如PTM不對稱識別（比如同一個核小體內的H3二聚體分別進行了不同的PTM修飾）或者攜帶有不同PTM的兩個相鄰核小體間的反式相互作用（trans inter-nucleosomal interactions）等。不過隨著DNL技術的不斷推廣和應用，這些問題在未來肯定會得到妥善的解決。無論如何，這種新技術在解析復雜的染色質調控因子招募和作用這個領域一定會做出更大的成績。

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