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【ISCO】反相RediSep®柱在肽分離中的應(yīng)用與優(yōu)化
閱讀：951發(fā)布時(shí)間：2024-11-19
一、應(yīng)用概述
肽可以被定義為氨基酸的短鏈聚合物。單個(gè)肽的特性當(dāng)然取決于其特定的氨基酸組成和排列方式。肽具有相對(duì)的極性，其結(jié)合特性與其他蛋白質(zhì)相當(dāng)一致。
肽混合物可以被分離成單個(gè)肽種類。如果可以將這些單獨(dú)且更具體的肽包含在一個(gè)單一的餾分中，這將極大地加速許多科學(xué)過(guò)程。
以下是一個(gè)通用的方法，用于在可重復(fù)使用的反相RediSep® C18柱上將肽混合物分離成餾分。
通常最好從4.3克的RediSep反相柱開始。在探索特定肽的良好參數(shù)時(shí)，會(huì)使用較少的肽樣品和溶劑。一旦確定了洗脫參數(shù)，就可以根據(jù)需要擴(kuò)大過(guò)程規(guī)模。回顧反相理論的應(yīng)用說(shuō)明AN10可能是有益的。
對(duì)于本參考文獻(xiàn)中使用的特定肽混合物，參數(shù)列于表1中。參數(shù)將隨肽結(jié)構(gòu)而變化。
表格1：通用方法參數(shù)
二、通用方法波長(zhǎng)
理想的波長(zhǎng)會(huì)根據(jù)肽的結(jié)構(gòu)而變化。選擇具有最高靈敏度的波長(zhǎng)是理想的，同時(shí)避免引入過(guò)多噪聲或遺漏某些化合物。如果210 nm過(guò)于嘈雜，那么214 nm通常會(huì)提供一個(gè)更干凈的基線。環(huán)狀結(jié)構(gòu)在280 nm處吸收最好，雙鍵在254 nm處，單鍵在210 nm處。推薦的通用波長(zhǎng)對(duì)于蛋白質(zhì)和肽是210 nm。
反離子
為了提高肽和柱的性能，通常使用反荷離子。這有助于提供更均勻的分離，從而改善柱性能。常用的反荷離子是0.1%（體積比）三氟乙酉夋（TFA）。將其等量添加到A和B移動(dòng)相中。在整個(gè)分離過(guò)程中保持穩(wěn)定反荷離子濃度會(huì)得到更一致的基線。簡(jiǎn)單的配制方法是每升移動(dòng)相中加入1毫升（0.1% v/v）。直接用移液管將TFA加入到移動(dòng)相中并彳切底混合。
柱負(fù)載
這個(gè)參數(shù)根據(jù)肽的組成有很大的變化。對(duì)于4.3克的RediSep反相柱，0.5毫克應(yīng)該是一個(gè)好的起點(diǎn)。
柱構(gòu)造
柱本身由三個(gè)主要部分組成：
1. 支持介質(zhì)是固定相所綁定的固體表面。
2. 固定相是附著在支持介質(zhì)上的活性涂層，即C18。
3. 移動(dòng)相是流過(guò)支持介質(zhì)的流體，以便將肽的活性部分暴露給固定相。
移動(dòng)相或溶劑系統(tǒng)
許多肽強(qiáng)烈地吸附在C18上，通常需要一個(gè)強(qiáng)梯度來(lái)洗脫。典型地，水用作溶劑A，乙腈用作溶劑B來(lái)洗脫肽。
梯度
在建立新方法時(shí)，通常建議創(chuàng)建一個(gè)從0到95% B溶劑的非常緩慢的梯度，以確保所有峰都被洗脫并且柱子被清潔。
在初始的0-95%梯度運(yùn)行后，洗脫輪廓大致確定，可以根據(jù)特定肽的需要修改梯度。通過(guò)在特定的保留時(shí)間改變梯度的斜率，可以優(yōu)化分離時(shí)間和峰形。
三、分析結(jié)果
圖1提供了一個(gè)參考肽的色譜圖。特定的肽是使用表1中列出的參數(shù)進(jìn)行分離的。參數(shù)將隨著肽的結(jié)構(gòu)而變化。
圖1：樣品肽色譜圖
四、總結(jié)
肽的純化方法可以先在較小的柱上建立，然后根據(jù)所需的樣品負(fù)載量進(jìn)行放大。
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