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干貨丨PCR功能簡介

時間：2019-2-28 閱讀：5630

年初，中國科幻電影“小破球流浪地球”持續(xù)熱映，片中洗腦循環(huán)的經(jīng)典臺詞讓觀眾會心一笑，小寶覺得這句話用在科研界一樣適用：新手除了了解基本的實驗操作原理及步驟之外，還應(yīng)對實驗儀器有大致的認(rèn)知，能夠讓儀器輔助實驗順利進(jìn)行。

在初次接觸PCR儀時，小白們都會有各種各樣的困惑。譬如：PCR儀上的熱蓋和PCR管蓋作用一樣嗎？，不同品牌的熱蓋都是一樣的嗎？熱啟動又是什么意義？兩個加熱模式哪種情景適用？帶著這些問題，小寶給大家一一解答！

*，PCR儀又稱熱循環(huán)儀，是配合PCR過程的變溫儀器，熱蓋是儀器上方的一部分，用來避免樣品在高溫環(huán)境下蒸發(fā)冷凝在管蓋上而減少反應(yīng)樣品體積的風(fēng)險。

PCR又稱聚合酶鏈反應(yīng)，是體外擴(kuò)增目的DNA片段的方法，在多方面廣泛應(yīng)用，主要分為三大步驟：高溫變性、低溫退火、適溫延伸。分別添加引物、模板、Taq酶、dNTP和緩沖液等反應(yīng)物混合，在約為95℃環(huán)境下，雙鏈DNA氫鍵斷裂解旋為單鏈；單鏈與人工設(shè)計的引物在約為60℃溫度下，按照堿基互補配對的原則相結(jié)合；并升溫到72℃左右，利用Taq酶延伸合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。

在此過程中，某段溫度會接近或高于100℃，部分樣品會隨著高溫向上蒸發(fā)，遇上溫度較低的PCR管蓋，則會冷凝在管蓋上，管內(nèi)的樣品就會有一定損失，少一部分沒有參加循環(huán)，造成樣品得率降低。

在此之前儀器還不具備這個裝置，是通過樣品里滴加石蠟油來解決此問題的，但實際上后續(xù)對石蠟油的處理較為繁瑣。后續(xù)熱蓋的出現(xiàn)能夠有效避免該風(fēng)險，熱蓋的溫度一般都會比模塊高5-10℃，這樣模塊內(nèi)的PCR管上端溫度始終大于反應(yīng)液的溫度，由于高溫處壓強大于低溫處壓強，液體不會向上蒸發(fā)，于是所有的樣品反應(yīng)液體積不會發(fā)生變化。

但由于樣品管的高度不一，早期的儀器不可調(diào)熱蓋只能用于統(tǒng)一高度的樣品管，當(dāng)使用較矮的樣品管時，需要加入鋁塊，較為麻煩；目前可調(diào)式熱蓋分為旋鈕式和自調(diào)節(jié)式等：有些儀器旋鈕式熱蓋的高度和壓力是根據(jù)樣品管可調(diào)整：但換樣之前需要將旋鈕旋回原位。并且存在壓力不好控制的問題：過緊會使樣品管變性等；過松則無法達(dá)到相應(yīng)溫度影響結(jié)果。自調(diào)節(jié)則可根據(jù)樣品管高低調(diào)節(jié)高度。

所謂熱啟動則是在樣品管中添加的Taq酶用于適溫延伸這一步驟，但往往在室溫的環(huán)境下，Taq酶也能發(fā)揮作用，因此在加反應(yīng)物或是高溫變性前，都需要防止Taq酶在非適當(dāng)溫度下開始工作，以避免該情況下非特異性產(chǎn)物。模板和酶數(shù)量一定，產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物，這說明特異性產(chǎn)物含量會降低，因此，會在冰上加樣，或是先預(yù)熱PCR儀，再迅速放入PCR管。

還可以將凝固冷卻的蠟將引物，Mg²⁺，dNTP，和緩沖液混合和剩余反應(yīng)組分上、下層隔離開來。在變性階段，蠟受熱熔化，所有成分混合，且液態(tài)蠟浮到樣品的上部，充當(dāng)熱蓋的作用，但后續(xù)蠟處理較為棘手。利用化學(xué)修飾或者制備抗原抗體復(fù)合物等方法使得其按照溫度高低控制酶活性。

石蠟熔化示意圖（管內(nèi)黃色部分為石蠟）

面對高通量的樣品，手動熱啟動防護(hù)會十分耗時，因此，PCR儀會設(shè)定熱蓋溫度，當(dāng)熱蓋加熱到一定溫度之前，模塊溫度保持不變；熱蓋溫度達(dá)到設(shè)定值時，模塊迅速升溫，達(dá)到熱啟動的效果。

另外，很多PCR儀在加熱模式上有Tube、Block兩種方式可選。這是因為儀器的溫度傳感器在模塊下部，實際上無法測得樣品管內(nèi)的溫度。一般情況（Block）下，在輸入設(shè)定溫度及運行時間時，指的是模塊在到達(dá)溫度下持續(xù)相應(yīng)的時間，樣品管的溫度不能迅速達(dá)到的溫度；而Tube模式是先將模塊溫度高于設(shè)定溫度，等樣品管溫度到達(dá)溫度，再將模塊溫度降到溫度，這樣能快速使管內(nèi)溫度達(dá)到設(shè)定值。不同反應(yīng)體積和要求可使用不同的模式：普通PCR或體積較大使用Tube模式，當(dāng)長時間保溫且對溫度過沖要求較高或是體積較小時，可以使用Block模式。