取人外周血（肝素抗凝）200 ml加入24孔板內，加入800 ml的*培養基，再加入1ml PMA(25ug/ml)、1μl Ionomycin（1mg/ml），輕輕吹打混勻細胞。放入 CO2培養箱培養刺激0.5小時后，每孔再加入2μl Brefeldin A（5mg/ml），輕輕吹打混勻細胞，放入CO2培養箱培養刺激3.5小時。

流式檢測步驟：

1、收集細胞于流式管內，500 g/8min離心，槍頭吸去上清，彈散管底沉淀，加入相應的表面染色抗體（CD3\CD8），彈散混勻。室溫避光孵育15分鐘后，500 g/8min離心，槍頭吸去上清；

2、彈散管底沉淀，加入1ml的固定/破膜工作液，（1ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3ml Fixation/Permeabilization Diluent稀釋），旋渦混勻,現配現用；

3、室溫避光孵育30分鐘， 600 g/10min離心，在吸水紙上倒扣流式管棄去上清（此時細胞已在管底形成很牢固的沉淀，不容易丟失），彈散管底沉淀；

4、加入1ml Permeabilization Buffer(此為10X，須與蒸餾水1：10稀釋成工作液)工作液離心洗滌細胞，破膜15分鐘（室溫避光）， 600 g/10min，在吸水紙上倒扣流式管棄去上清，彈散管底沉淀；

5、加入100μl Permeabilization Buffer（1x），同時加入相應的細胞因子染色抗體，室溫避光孵育15分鐘；

6、加1ml Permeabilization Buffer（1x），600 g/ 8min；在吸水紙上倒扣流式管棄去上清；彈散管底沉淀；

7、加入適量體積（建議300~500 ml）的PBS重懸細胞，并上機檢測并分析。

注意：1、根據實驗需求選擇相應的抗體，并做單染管用于調節補償（具體如何設置單染管，可參照Biogems流式手冊補償章節介紹）。

2、盡量做同型對照，因細胞因子表達量不高（尤其是IL-4表達量非常低），細胞因子抗體對應的同型對照一般都要做。

3、PMA刺激會導致人T細胞表面CD4表達的下調，PMA與Lonomycin聯合刺激下調非常明顯，4h刺激后會下調50%以上，6h刺激幾乎檢測不到CD4，因此我們的界定CD4+T細胞是通過染CD3和CD8，來圈CD3+CD8-的細胞。

4、PMA對小鼠T細胞CD4表達影響很小，因此可以直接染CD4來圈門。

5、因破膜劑對細胞損傷較大，建議離心后形成的細胞沉淀先彈散形成細胞懸液，在加入破膜劑，這樣會減少對細胞的損傷（形成的細胞碎片較少）。

人外周血TH1/TH17染色結果

注意：細胞破膜后對形態影響較小，因此可以直接圈淋巴門分析，在通過圈CD3+CD8-的細胞（此處未列出圖）來分析CD4+的細胞表達細胞因子的量。因此此圖橫坐標就直接標的CD4。

人TH1/TH2/TH17染色所需抗體及輔助試劑

品牌	產品編號	產品名稱	規格	價格
BioGems	05111-60	Anti-Human CD3 PE	25 test/100 tests	700元/
BioGems	10111-50	Anti-Human CD8a FITC	25 test/100 tests	560元/
BioGems	80811-80	Anti-Human IFN gamma APC	25 test/100 tests	1680元/
BioGems	81111-77	Anti-Human IL-4 PE-Cy7	25 test/100 tests	1890元
BioGems	73821-60	Anti-Human IL-17A PE	25 test/100 tests	1890元
BioGems	44212-80-100	Mouse IgG1 Isotype Control APC	100 mg	1750元
BioGems	44212-77-100	Mouse IgG1 Isotype Control PE-Cy7	100 mg	1890元
BioGems	44212-60-100	Mouse IgG1 Isotype Control PE	100 mg	1890元
BioGems	2031560-5mg	Brefeldin A	5 mg	880元
BioGems	5608212-1mg	Ionomycin (calcium salt)	1 mg	880元
BioGems	1652981-1mg	Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA	1 mg	880元
BioGems	92110-00-150	Permeabilization Buffer (10X)	150 ml	1030元
BioGems	92160-00-160	Transcription Factor Fixation/Permeabilization Diluent	160 ml	420元
BioGems	92550-00-50	Transcription Factor Fixation/Permeabilizatio Concentrate	50 ml	1050元
			總價	17390元

方案提供：Biogems*。Biogems是PeproTech的流式抗體品牌，優勢是基于優異品質的較低價位，現正進行一系列*活動。

TH1/TH2/TH17流式抗體檢測配色方案產品由重慶市華雅干細胞技術有限公司授權代理，：

重慶市華雅干細胞技術有限公司，：

重慶市華雅干細胞技術有限公司以“專注干細胞研究，提升干細胞品質”為發展理念，專業從事干細胞基礎研究、干細胞再生醫學臨床應用研究及干細胞技術服務。

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