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蛋白樣品制備詳解—酶類篇
閱讀：2189發(fā)布時間：2021-9-16
當細胞破碎的時候，蛋白水解酶就會被釋放出來或被激活，使電泳結果復雜化，影響最終結果分析。為了避免這些情況的出現，建議在樣品制備時盡可能在低溫下進行。此外，許多蛋白酶在PH9以上就失活了，因此Tris堿，碳酸鈉或堿性載體兩性電解質往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持著活性，此時應當使用蛋白酶抑制劑。因此對于我們想要研究的蛋白來說，選擇性和有效的抑制這些蛋白酶對于蛋白純化路線設計來說顯得尤為重要。
蛋白酶抑制劑與蛋白酶一樣，都是紛繁復雜的，通常使用許多化學物質作為蛋白酶抑制劑，如PMSF 和leupeptin。而且由于一種蛋白酶抑制劑只對某一類蛋白酶起作用，因此通常建議復合使用蛋白酶抑制劑，如廣譜蛋白酶抑制劑“雞尾酒"。
但是這樣配置溶液進行處理，有時也是頗為麻煩，而且效果可能并不好，目前有一些廠家試劑在簡便操作，和抑制效果方面有不俗的表現，可以考慮在實驗中選用，節(jié)約時間和便于結果分析。
比如，G-Biosciences的ProteaseArrest™蛋白酶抑制劑也許就能滿足這種需要，ProteaseArrest™是一種常規(guī)的蛋白酶抑制劑混合物，提供100X濃縮的即用溶液。這種100X濃度的溶液適用于小量，分析樣本的應用。在1ml樣本中加入10微升的ProteaseArrest可以達到大于95%的抑制效率。對于樣本中含量高的蛋白酶的情況，可以適當增加ProteaseArrest的量來達到更大的抑制效率。
抑制劑混合物包括針對絲氨酸、半胱氨酸、鈣蛋白酶和金屬蛋白酶可實現可逆和不可逆的抑制。可選擇的EDTA的溶液可實現增強的金屬蛋白酶的抑制。EDTA并不存在于ProteaseArrest混合物溶液中，它將抑制那些需要二價陽離子（Ca2+, Mg2+ 或Mn2+）來起作用的蛋白質的活性。除此之外，EDTA會抑制那些通過使用固定金屬親和層析色譜純化得到的蛋白，也包括6XHis標簽重組蛋白。
由于各種抑制劑組分的*化的濃度，ProteaseArrest表現出優(yōu)異的蛋白酶活性的抑制，因而它適合在從動物組織，酵母，植物和細菌中進行蛋白純化和樣本制備過程中來保護蛋白。
ProteaseArrest也有獨立包裝的小包裝，能夠在10ml的溶液中達到大于95%的抑制效率。這種OneQuant™小包裝主要是為了科研人員方便使用。
實重要的是ProteaseArrest也可以根據實驗的情況來優(yōu)化蛋白酶抑制劑的濃度，比如組織中含有高于常規(guī)量的蛋白酶的時候，可以加入2X或者更高濃度的ProteaseArrest的量。
在研究中，發(fā)現1X濃度的ProteaseArrest的蛋白酶抑制效率達到了95%（0.5mg/ml的小鼠的胰腺提取物為例）。
除了蛋白酶抑制劑以外，在許多研究過程中，尤其是一些制藥公司和研究院在研究藥理學機制的時候，需要了解蛋白磷酸化途徑，因此一個重要的步驟就是準確的觀察一般和特異的磷酸化狀態(tài)，所以蛋白抽提的另一個重要保護過程就是對磷酸化狀態(tài)的有效保護。
磷酸化的蛋白可以被非特異性的磷酸酶（例如：堿性磷酸酶），特異性的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶、酪氨酸蛋白磷酸酶或雙重特異性磷酸酶去磷酸化。針對這種情況G-Biosciences也推出了一種PhosphataseArrest™磷酸酶抑制劑混合物，它能夠保持細胞和組織中蛋白的磷酸化狀態(tài)。PhosphataseArrest™包括3種抑制劑產品。
phosphataseArrest™ I
一種廣泛的磷酸酶抑制劑混合物包括5種磷酸酶抑制劑，能夠特異性的抑制絲氨酸/蘇氨酸，和酪氨酸雙重特異性的磷酸酶。PhosphataseArrest™ I是一種穩(wěn)定的溶液組成，含有氟化鈉，正釩酸鈉，焦磷酸鈉，β-磷酸甘油，鉬酸鹽等。
磷酸酶抑制劑 | 分子量 | 靶向磷酸酶 |
氟化鈉 | 42 | 酸性磷酸酶 |
正釩酸鈉 | 183.9 | 酪氨酸磷酸酶，堿性磷酸酶 |
焦磷酸鈉 | 221.94 | 絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶 |
β-磷酸甘油 | 306.1 | 絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶 |
鉬酸鹽 | 205.92 | 酸性磷酸酶 |
PhosphataseArrest™ II
一種廣泛的磷酸酶抑制劑混合物包括5種磷酸酶的抑制劑能夠抑制酸性，堿性和酪氨酸磷酸酶。PhosphataseArrest™ II含有優(yōu)化濃度的氟化鈉，酒石酸鈉，正釩酸鈉，咪唑和鉬酸鹽。
磷酸酶抑制劑 | 分子量 | 靶向磷酸酶 |
氟化鈉 | 42 | 酸性磷酸酶 |
正釩酸鈉 | 183.9 | 酪氨酸磷酸酶，堿性磷酸酶 |
酒石酸鈉 | 230.08 | 酸性磷酸酶 |
咪唑 | 68.08 | 堿性磷酸酶 |
鉬酸鹽 | 205.92 | 酸性磷酸酶 |
PhosphataseArrest™ III
一種廣泛的磷酸酶抑制劑混合物包括3種磷酸酶的抑制劑能夠抑制堿性和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。PhosphataseArrest™ III是一種穩(wěn)定的，方便的溶液，由斑蝥素，對溴四咪唑草酸鹽和腫瘤促進劑組成。
磷酸酶抑制劑 | 分子量 | 靶向磷酸酶 |
斑蝥素 | 196.2 | 絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶 |
對溴四咪唑草酸鹽 | 373.23 | 堿性磷酸酶 |
腫瘤促進劑 | 1009.17 | 絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶 |
總而言之，在實驗中適當的選擇一些經過嚴格的質量監(jiān)控的產品，想來相比較于家制的雞尾酒而言具有更好的使用重復性，和有效性，讓我們在下游應用中得到更潔凈和清晰的結果。
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