奧林巴斯CX33顯微鏡明場熒光觀察葉片氣孔

使用奧林巴斯 CX33 顯微鏡通過明場和熒光觀察葉片氣孔，具體步驟如下：

奧林巴斯 CX33 顯微鏡樣品準備

葉片采集：選取健康、具有代表性的植物葉片。盡量在植物生長旺盛期采集，以保證氣孔處于正常生理狀態。

葉片處理：將采集的葉片用清水沖洗干凈，去除表面的灰塵和雜質。對于一些較厚或有蠟質層的葉片，可以用刀片輕輕刮去表面的蠟質，以便后續染色劑和熒光染料更好地滲透。

染色與熒光標記

明場觀察染色：對于明場觀察，可使用亞甲基藍等染料對葉片進行染色。將葉片浸泡在 0.1% - 0.5% 的亞甲基藍溶液中 5 - 10 分鐘，然后用清水沖洗，去除多余的染料。亞甲基藍可以使氣孔周圍的細胞結構著色，便于在明場下觀察氣孔的形態和分布。

熒光觀察標記：選擇合適的熒光染料標記葉片氣孔。例如，用碘化丙啶（PI）對葉片進行染色，它可以標記細胞的細胞壁和細胞核等結構，使氣孔在熒光下更易觀察。將葉片浸泡在含有適量 PI（如 5 - 10 μg/mL）的溶液中 15 - 20 分鐘，然后用緩沖液沖洗干凈。PI 在藍光激發下會發出紅色熒光，能清晰地顯示出細胞輪廓，從而突出氣孔結構。

奧林巴斯 CX33 顯微鏡顯微鏡設置

明場設置

調整光源：打開奧林巴斯 CX33 顯微鏡的光源，通過調節亮度旋鈕將光源強度調整到合適的水平。一般來說，對于觀察葉片氣孔，中等強度的光源即可，過強的光源可能會導致圖像過亮，影響對比度，而過弱的光源則會使圖像較暗，細節難以看清。

選擇物鏡和目鏡：根據葉片的大小和觀察的詳細程度要求，選擇合適的物鏡和目鏡組合。通常，10 倍或 20 倍的物鏡可用于整體觀察葉片氣孔的分布情況，40 倍或更高倍數的物鏡則用于觀察氣孔的細微結構。目鏡一般選擇 10 倍的即可滿足大多數觀察需求。

調節聚光器：通過上下移動聚光器，使光線聚焦在樣品上，以獲得最佳的照明效果和圖像對比度。聚光器的高度和孔徑光闌的大小會影響光線的匯聚程度和樣品的照明均勻性，需要根據實際觀察情況進行微調。

熒光設置

選擇濾光片組：根據所使用的熒光染料的激發和發射波長，選擇相應的熒光濾光片組。如使用 PI 染色，需要選擇能夠激發 PI 熒光（通常為藍光激發）且能過濾掉其他波長光線的濾光片組，以確保只有 PI 發出的紅色熒光能夠被觀察到，避免其他雜散光的干擾。

設置激發光強度和曝光時間：熒光觀察時，要根據熒光信號的強弱適當調整激發光強度和曝光時間。開始時，可將激發光強度設置為較低水平，曝光時間設置為較短值，然后根據觀察到的熒光圖像的亮度和清晰度，逐漸調整這兩個參數，以獲得最佳的熒光圖像效果。但要注意避免激發光強度過高和曝光時間過長，以免引起熒光淬滅和樣品損傷。

觀察與記錄

奧林巴斯 CX33 顯微鏡明場觀察

放置樣品：將處理好的葉片樣品放在顯微鏡載物臺上，用載玻片和蓋玻片固定好，確保葉片平整，避免產生褶皺或氣泡影響觀察。

對焦與觀察：通過粗調焦旋鈕將物鏡靠近樣品，然后緩慢調節微調焦旋鈕，使葉片圖像清晰對焦。首先在低倍物鏡下找到葉片的邊緣或葉脈等標志性結構，然后移動載物臺，找到含有氣孔的區域。觀察氣孔的形態、大小、分布密度以及周圍細胞的結構特征。注意觀察氣孔是開放狀態還是關閉狀態，記錄不同部位氣孔的特點。

LV2000顯微鏡相機圖像記錄：如果顯微鏡配備了成像系統，可以拍攝明場下葉片氣孔的圖像。拍攝時，要確保圖像清晰、對比度良好，能夠準確反映氣孔的形態和分布情況。可以拍攝多張不同視野的圖像，以便后續分析和比較。

熒光觀察

切換到熒光模式：在明場觀察完成后，關閉明場光源，切換到熒光照明模式。確保熒光濾光片組已正確插入光路中。

重新對焦與觀察：由于熒光圖像的焦點可能與明場略有不同，需要再次微調焦旋鈕，使熒光圖像清晰對焦。觀察葉片氣孔在熒光下的形態和分布。注意熒光信號的強度、分布范圍以及與周圍細胞結構的關系。例如，PI 染色后，氣孔周圍的細胞壁會發出紅色熒光，形成清晰的輪廓，可更準確地觀察氣孔的邊界和形狀。

圖像記錄與分析：使用成像系統拍攝熒光圖像，記錄氣孔在熒光下的特征?？梢詫晒鈭D像進行進一步的分析，如測量氣孔的面積、周長等參數，或者分析熒光強度的分布情況，以獲取更多關于氣孔結構和功能的信息。

在觀察過程中，要保持實驗環境的穩定，避免震動和溫度變化對顯微鏡成像的影響。同時，為了獲得更準確和全面的結果，可以對多個不同品種、不同生長條件下的葉片進行觀察和比較，分析葉片氣孔在不同情況下的差異和特點。