分別設定標準孔、0孔和樣本孔，計算好當次試驗所需要的板條數量，將不需要的板條拆卸下來，用新的封板膜重新封好，放回裝有干燥劑的鋁箔袋。

浸泡酶標板：加入300 μL 1×洗滌液靜置浸泡30秒，棄掉洗滌液之后，在吸水紙上將微孔板拍干，重復2次。

加標準品：標準品孔加入100 μL的2倍倍比稀釋的標準品。0孔加入100 μL標準品/樣本稀釋液。

加樣本：樣本孔加入100 μL的待測樣本。保證連續加樣，不要間斷。加樣過程在10 min內完成。

孵育：使用新的封板膜封板。37℃靜置孵育90 min。

洗滌：棄掉液體，每孔加入300 μL洗液洗板，洗滌4次。每次洗板，在吸水紙上拍干。

加生物素化檢測抗體：加入100 μL生物素化抗體工作液至反應孔中。

孵育：使用新的封板膜封板。37℃靜置孵育60 min。

洗滌：棄掉液體，每孔加入300 μL洗液洗板，洗滌4次。每次洗板，在吸水紙上拍干。

加酶結合物：加入100 μL酶結合物工作液至反應孔中。

孵育：使用新的封板膜封板。封板后于37℃靜置孵育30 min。

洗滌：棄掉液體，每孔加入300 μL洗液洗板，洗滌5次。每次洗板，在吸水紙上拍干。

加底物顯色：每孔加入100 μL顯色底物TMB，避光，37℃避光顯色15 min。

加終止液：每孔加入50 μL終止液，終止液加入的順序應盡量與顯色底物加入的順序相同。

檢測讀數：在5 min之內，使用酶標儀進行雙波長檢測，測定450 nm最大吸收波長和630 nm參考波長下的OD值。