近年來，隨著病理學研究領域的不斷深入，多重免疫標記技術逐步興起。多重免疫標記技術是一種可以在同張組織樣本上實現多重分子標記的免疫標記技術，配合定量分析工具，能夠對組織微環境中目標分子或細胞及其相關生物標志物進行全面分析。

傳統免疫熒光多重標記的基本模式是：第一抗體選擇不同的種屬來源，不同顏色的熒光二抗結合一抗時要滿足種屬匹配，區分不同種標記。

而今天小編給大家介紹的是一種基于經典HRP顯色免疫標記技術的熒光多重標記檢測方法，即酪酰胺信號放大（TSA）技術。TSA標記法是一項基于酪胺信號放大的多重順次免疫染色技術，可以在細胞或組織樣本原位檢測多個目標靶點，通過這些靶點的組合和位置關系的研究，進而闡明其相互作用機理，對于疾病診療和病理診斷有著重要意義。

TSA技術的染色流程與經典免疫組織化學染色步驟相近，值得注意的是，依次加入一抗的過程中，額外增加了修復熱處理洗脫步驟，該步驟可以將以非共價鍵結合在抗原上的抗體去除，但是仍然保留以共價鍵結合在抗原表面的TSA熒光信號，從而實現無抗體干擾的抗原直接標記，再經過多輪染色循環實現多色標記，無需考慮多種抗體之間的非特異反應。直至全部標記完成，復染DAPI后封片觀察即可。

1. TSA標記是穩定的共價結合，熒光信號穩定，基本不受連續孵育、熱修復和抗體剝離處理影響；

2. 可以使用同一種屬的不同一抗搭配同一二抗使用，極大減少交叉反應對實驗設計和實驗結果的影響。而且可以連續染色最后觀察也可逐步染色檢查染色結果；

3. 搭配強力過氧化物酶封閉液能有效去除本底酶活和殘留抗體對結果的影響；

4. 通過組合使用不同的TSA熒光染料，可對切片樣本進行單標記放大標記到最多6重抗體標記同切片顯示。

1. 修復液和修復條件根據組織類型以及抗原類型來確定；

2. TSA原理的多重熒光免疫組化中，由于染料是依次共價偶聯在切片上的，并需要通過加熱洗去前續抗體，因此需要確定染色順序，以保證：

A. 多次加熱切片不會影響后續靶點表位完整性；

B. 前續偶聯的熒光素能耐受后續加熱過程。

3. 多重染色需要平衡待檢樣品中靶點峰度和各通道信號強度。盡量做到：寡靶配強光，眾靶配弱光。

4. TSA增強信號會比熒光標記二抗信號高10-100倍，能夠使用更少抗體標記的同時也更容易由于抗體濃度過高造成非特異性著色。因此正式染色之前，建議先摸索各通道下每一個單抗的最佳濃度范圍。

5. 鑒于多通道曝光時間較長，須使用有效抗熒光衰減封片劑封片。亦可使用含DAPI的抗熒光衰減封片劑。