蛋白質(zhì)分析技術(shù)(Western Blot、ELISA、免疫熒光與免疫組化技術(shù))

1 原理：

將通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF膜上，然后與能特異性識(shí)別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗滌去除沒(méi)有結(jié)合的特異性抗體后，加入標(biāo)記的、能識(shí)別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測(cè)試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無(wú)特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過(guò)條帶的密度大小來(lái)進(jìn)行特異性蛋白的半定量。 

2 操作過(guò)程

SDS-PAGE電泳→轉(zhuǎn)膜（PVDF或硝酸纖維素膜）

封閉→一抗→洗滌→酶標(biāo)二抗反應(yīng)

洗滌→顯色或化學(xué)發(fā)光顯影

Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20mM of gossypol for 4, 8 

and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control.

Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10μM gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody.

3 注意的問(wèn)題

（1） 蛋白質(zhì)電泳

常用SDS-PAGE：?jiǎn)我粊喕M成的蛋白質(zhì)

非變性PAGE：多個(gè)不同亞基組成的蛋白質(zhì)

Tris-Tricine膠中電泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的電泳，能夠獲得較好的分離效果。

（2）轉(zhuǎn)膜

戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因?yàn)槭稚系挠椭瑫?huì)阻斷轉(zhuǎn)印。濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致

以適量的轉(zhuǎn)移Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜15－30min，如果是PVDF膜，必須先用甲醇激活后浸泡。

方向正確：凝膠在陰極，膜在陽(yáng)極

排去濾紙、膠和膜間的氣泡。

電轉(zhuǎn)時(shí)間：100V 1-2h,可根據(jù)蛋白分子量的大小靈活 選擇轉(zhuǎn)移結(jié)束后，凝膠用考馬氏亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置

（3）封閉

用5％脫脂奶粉或3％BSA

（含0.1％Tween20 TBS或PBS配制）

時(shí)間：室溫2h或4ºC隔夜

（4）顯色或顯影

顯色

辣根過(guò)氧化物酶：底物為DAB

堿性磷酸酶：底物為BCIP/NBT

化學(xué)發(fā)光顯影

常用。辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物（商品化產(chǎn)品）

注意：化學(xué)發(fā)光前將膜用不含Tween20的TBS或PBS洗滌一次曝光的時(shí)間和顯影的時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況而定

（5）膜的再利用

化學(xué)發(fā)光后的硝酸纖維素膜用Stripping Buffer洗滌后（洗滌Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2％SDS和100mm的? －2ME ）   用不同的一抗進(jìn)行雜交，檢測(cè)其它蛋白的表達(dá)情況。一張膜可以重復(fù)使用3－4次。堿性磷酸酶顯色的膜不能再進(jìn)行雜交

二、ELISA

1 原理：

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。測(cè)定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重復(fù)性好。 

ELISA 常用的酶和底物 

辣根過(guò)氧化物酶，底物為OPD, 深桔黃色 ，檢測(cè)波長(zhǎng)492nm

                  TMB， 藍(lán)綠色，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm

  堿性磷酸酶，底物為PNPP（對(duì)－消基苯磷酸酯）, 黃色 

              檢測(cè)波長(zhǎng)405nm

  ELISA各步驟的反應(yīng)時(shí)間

  包被：24－36h，蛋白濃度為1－5ug/ml

  封閉：37ºC 2h 或4ºC隔夜（3％BSA）

  樣本反應(yīng)時(shí)間：37ºC 45min-1h

  酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間： 37ºC 45min-1h

  顯色時(shí)間：15min(避光）

  設(shè)對(duì)照

可以一次包被多塊板，凍存?zhèn)溆?/p>

2 類型

（1）間接法測(cè)抗體

間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體，檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。 

常用于臨床血清中自身抗體的檢測(cè)，以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測(cè)。

(2) 雙抗體夾心法測(cè)抗原

是檢測(cè)抗原常用的方法。

只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。

常用的組合：?jiǎn)慰寺】贵w＋多克隆抗體

              單克隆抗體＋單克隆抗體 

后一組合是兩種單克隆抗體針對(duì)抗原上不同的相距較遠(yuǎn)的兩個(gè)抗原決定簇，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。

用途：測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。例如各種細(xì)胞因子的檢測(cè)。 

雙抗體夾心法測(cè)抗原的方法：

捕獲抗體包被→封閉（3％BSA）→待測(cè)抗原→洗滌（含0.1％Tween的PBS)→酶標(biāo)單抗或多抗→洗滌→顯色→檢測(cè)

(3)競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原

1）抗體固相測(cè)抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。

其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，后的顯色也愈淺。

方法：抗體包被→封閉→同時(shí)加入待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原→洗滌→酶底物→顯色→ELISA reader檢測(cè)

2）抗原固相測(cè)抗原

其原理是標(biāo)本中的抗原和固相抗原與一定量的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。標(biāo)本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的抗體愈少，后的顯色也愈淺。 

方法: 

a: 抗原包被96孔板；   b:封閉; 

c: 待測(cè)抗原與抗體反應(yīng)一定時(shí)間；   d: 加入96孔板 

e: 洗滌                 f：加入酶標(biāo)二抗 

g：洗滌               h：顯色和檢測(cè) 

（4）IgM抗體的檢測(cè) 

1）間接法： 

間接法ELISA一般僅適用于檢測(cè)總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定血清中的IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部分IgM抗體不能結(jié)合到固相上，將出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 因此，如果用抗IgM作為二抗，間接測(cè)定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。 

方法：

a: 抗原包被96孔酶標(biāo)板；   b:封閉; 

c: 待測(cè)血清與A蛋白反應(yīng)一定時(shí)間后離心 

d:   吸取上清液加入96孔酶標(biāo)板 

e: 洗滌                 f：加入酶標(biāo)抗IgM的抗體 

g：洗滌               h：顯色和檢測(cè) 

2）捕獲包被法（夾心法） 

先用抗人IgM抗體包被ELISA板，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（包括針對(duì)抗原特異性的IgM和非特異性的IgM)。然后加入相應(yīng)抗原，繼而加入針對(duì)抗原特異的酶標(biāo)抗體，再與底物作用，顏色的深淺即與標(biāo)本中的IgM含量成正相關(guān)。 

方法： 

a: 抗人IgM抗體包被96孔酶標(biāo)板；   b:封閉; 

c: 加入待測(cè)血清；     d:   洗滌96孔酶標(biāo)板 

e: 加入相應(yīng)抗原         f：加入抗原特異的酶標(biāo)抗體 

g：洗滌               h：顯色和檢測(cè) 

（5） ABS-ELISA技術(shù) （Avidin Biotin system-ELISA 

原理 

親和素是一種分子量是60，000的堿性蛋白，由四個(gè)相同亞基組成，每個(gè)亞基有一個(gè)生物素分子結(jié)合點(diǎn)。兩者均可與抗體等大分子生物活性物質(zhì)相偶聯(lián)，又可被酶類等多種材料所標(biāo)記，成為一種生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。生物素化抗體可捕獲多個(gè)親和素，后者再與酶結(jié)合，加入底物后，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。這一系統(tǒng)可以大大提高ELISA的靈敏度。   

操作過(guò)程： 

抗原包被→封閉→待檢標(biāo)本→生物素化抗體→洗滌→ 酶標(biāo)記親和素→洗滌→加底物顯色和檢測(cè) 

三 免疫熒光技術(shù) 

利用某些熒光素，如FITC、R-PE等通過(guò)化學(xué)反應(yīng)與抗體或其它蛋白結(jié)合制備成熒光探針，然后與被測(cè)抗原或配體發(fā)生特異性結(jié)合，形成的熒光復(fù)合物在一定波長(zhǎng)光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，因此利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)未知抗原或相應(yīng)配體。

（一）細(xì)胞膜蛋白分子的檢測(cè)

原理：

細(xì)胞膜表面的抗原或受體可特異地與相應(yīng)的抗體或配體結(jié)合，將針對(duì)細(xì)胞表面抗原的抗體或配體用不同的熒光素標(biāo)記，根據(jù)不同熒光物質(zhì)的大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的不同，即可準(zhǔn)確定量每種熒光物質(zhì)的強(qiáng)度，從而推出相應(yīng)細(xì)胞表面抗原表達(dá)量

1 直接法：細(xì)胞＋熒光素標(biāo)記的抗CD分子的抗體→4ºC反應(yīng)30-60min→熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析。

2 間接法：細(xì)胞＋抗CD分子的抗體→4ºC 反應(yīng)30-60min 熒光素標(biāo)記的二抗 4ºC 反應(yīng)30-60min→熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析

懸浮細(xì)胞：用PBS洗二次后再做染色 

貼壁細(xì)胞：先用胰酶消化成懸浮細(xì)胞再染色 

2 Annexin V檢測(cè)技術(shù) (檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一個(gè)常規(guī)指標(biāo))

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

樣本處理和染色方法

1 懸浮細(xì)胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反應(yīng)5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)（一般不超過(guò)1h）， 同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對(duì)照。 

2 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細(xì)胞。 

3 爬片細(xì)胞染色：同上，后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。 

（二）細(xì)胞內(nèi)蛋白分子的檢測(cè)

細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19的檢測(cè)等。

操作過(guò)程： 

（1）直接法： 

細(xì)胞→3％多聚甲醛固定和 滲透化→封閉→熒光素標(biāo)記的抗體→ 洗滌→熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析   

（2）間接法： 

細(xì)胞→3％多聚甲醛固定和滲透化→封閉→針對(duì)蛋白的特異抗體→洗滌→熒光素標(biāo)記的二抗→洗滌 → 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析 

凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析 

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在上先報(bào)導(dǎo)的一個(gè)擁有自己知識(shí)產(chǎn)權(quán)的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)劑。利用熒光素（FITC）標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針，對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程中TFAR19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達(dá)水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細(xì)胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進(jìn)一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細(xì)胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。這為研究細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提供了一種新的技術(shù)和指標(biāo)。

1 懸浮細(xì)胞的染色：

（1）收獲正常和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞（0.5~1×106），PBS洗2次， 

（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。

（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，

（4）加入200ml胎牛血清，室溫反應(yīng)30min。

（5）加入 FITC標(biāo)記的TFAR19單抗，4°C反應(yīng)30min

（6）熒光細(xì)胞洗液洗2次，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。同時(shí)用流式細(xì)胞計(jì)定量檢測(cè)TFAR19蛋白的平均熒光強(qiáng)度。

2：貼壁細(xì)胞的原位染色

（1） 貼壁生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期細(xì)胞鋪在24孔或6孔板中（內(nèi)有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長(zhǎng)，待長(zhǎng)到50%~80%滿時(shí)，凋亡誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞。

（2） 將不同時(shí)間點(diǎn)處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，染色步驟同上。

（3） 將染色的爬片細(xì)胞放于一張滴有少量甘油（5ul）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。

四免疫組織化學(xué)技術(shù)

原理：

是指酶標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的成色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)的抗原進(jìn)行定性、定位和定量測(cè)定的一項(xiàng)技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見(jiàn)性巧妙的結(jié)合起來(lái)，借助顯微鏡（包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡等）的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等），并可在原位顯示相應(yīng)的基因和基因表達(dá)產(chǎn)物。

免疫組化染色技術(shù)的分類

免疫熒光法（Immunofluorescence technique）

免疫酶法（Immunoperoxidase technique）

免疫金銀法（（Immunogold technique）

ABC法（ Avidin-Biotin Complex）

五 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)

1 GST融合蛋白進(jìn)行Pulldow實(shí)驗(yàn) 

  （1）原理

  細(xì)菌表達(dá)的谷胱甘肽s－轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將GST融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結(jié)合，然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白的能力來(lái)確定相互作用的蛋白。一般在得到目標(biāo)蛋白的抗體前，或發(fā)現(xiàn)抗體干擾蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)之間的相互作用時(shí)，可以啟用GST沉降技術(shù)。該方法只是用于確定體外的相互作用。

  兩種應(yīng)用：

  1）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用

  2）證實(shí)探針蛋白與已知蛋白質(zhì)間可疑的相互作用   

（2）方法：

  1） GST融合蛋白先與下列蛋白溶液之一孵育（a, 單一明確的重組蛋白；b，細(xì)胞裂解蛋白混合液；c, 體外翻譯cDNA表達(dá)得到的未知蛋白）

  2）混合液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠反應(yīng) 4ºC 2h

  3）離心棄上清

  4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，離心

  5）取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，

  6）考馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶，進(jìn)一步做質(zhì)譜分析確 定沉降的蛋白；電泳后的膠也可以做Western Blot來(lái)確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白

該實(shí)驗(yàn)設(shè)立GST對(duì)照，反應(yīng)均在4ºC進(jìn)行

2 免疫共沉淀

（1）原理

當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。

如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。

這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔

缺點(diǎn)：可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用

免疫共沉淀檢測(cè)蛋白質(zhì)的原理和常見(jiàn)問(wèn)題

（2）方法

1) 收獲培養(yǎng)的細(xì)胞（1×107－1×108）冷PBS洗滌2次

2）細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30min

3) 12000rpm   離心 30min

4）收集上清并加入適量抗體，4ºC搖動(dòng)1h

5）加入ProteinG-Sepharose懸液， 4ºC搖動(dòng)1h

6）細(xì)胞裂解液洗滌ProteinG-Sepharose混合液

7）離心棄上清

8）沉淀加2×蛋白Loading Buffer煮沸5－10min

9）離心，上清液跑SDS-PAGE 膠

10）考馬氏亮蘭染色、銀染

    Western Blot     質(zhì)譜分析

（3）注意的問(wèn)題

1）細(xì)胞裂解

采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)

  相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。

  不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。

2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用

3）使用對(duì)照抗體：

      單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗

      兔多克隆抗體：正常兔IgG

3 酵母雙雜交系統(tǒng) 

（1）原理：

將編碼某一蛋白X的DNA序列與DNA結(jié)合域BD的編碼序列融合形成一個(gè)雜交體，將編碼另一蛋白Y的DNA序列與DNA激活域AD的編碼序列融合形成另一個(gè)雜交體，當(dāng)兩個(gè)雜交體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞（此酵母細(xì)胞上游有DNA結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因），若X和Y沒(méi)有相互作用，則單獨(dú)不能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；若X和Y可相互作用，則使BD和AD靠近形成一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄激活子，激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。因此可通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)研究蛋白質(zhì)X和Y的相互作用。 

1）已知蛋白之間相互作用的檢測(cè)：

2）蛋白質(zhì)的功能域研究：通過(guò)對(duì)其中某一個(gè)蛋白質(zhì)作缺失或定點(diǎn)突變，再用此系統(tǒng)檢測(cè)是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關(guān)鍵氨基酸；

3）克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質(zhì)基因與BD基因構(gòu)建成“誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，將某一器官或組織的cDNA文庫(kù)與AD基因構(gòu)建成“獵物”基因庫(kù)，共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，可篩到與感興趣蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的cDNA序列，并推測(cè)其蛋白質(zhì)序列。

4 蛋白質(zhì)芯片

其制作原理類似于基因芯片，所不同的是，蛋白、多肽芯片所用的樣品是提純的蛋白、多肽。其檢測(cè)的原理類似于抗原、抗體檢測(cè)的ELISA法。如采用雙抗夾心的形式，可通過(guò)機(jī)械點(diǎn)涂的方法，將多種不同的單克隆抗體點(diǎn)樣固定在固相介質(zhì)表面，如PVDF膜上，制備成抗體蛋白芯片，與制備的多種抗原樣本雜交、結(jié)合，芯片上的抗體捕獲相應(yīng)的抗原，然后再與標(biāo)記的多種不同的抗體雜交，由于抗原具有多價(jià)結(jié)合表位而結(jié)合標(biāo)記抗體，根據(jù)雜交信號(hào)的有無(wú)、多少而進(jìn)行定性、定量的分析。 

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