實驗一：大腸桿菌DH5α和BL21感受態細胞的制備 
【實驗步驟】 
1 從LB平板上挑取新活化的大腸桿菌DH5α單菌落，接種到5mL LB培養基中，37℃振蕩培養過夜。 
2 取1mL培養物接種到100mL LB培養基（250mL三角瓶）中，37℃振蕩培養2~3h。 3 將菌液轉移到50mL離心管（2管）中，冰上放置15min。 4 4℃ 4000 rpm 離心5min，棄去上清液，倒置使培養液流盡。 
5 用20 mL 冷CaCl2溶液懸浮菌體沉淀合并成一管，在4℃ 4000 rpm 離心5min，棄去上清液。 
6 用10 mL 冷CaCl2溶液懸浮菌體沉淀，冰浴30min。 
7  4℃ 4000 rpm 離心5min，棄去上清液，用2 mL的冷CaCl2溶液懸浮。 8 分裝到數個EP管中，每管200 uL，冷凍保存備用。 

實驗二：目的基因質粒（T-SOD或T-IL218） 
和表達載體質粒（PET32或PET30）的轉化及大量提取 
【實驗步驟】 
一、載體的轉化（無菌條件，冰上進行） 1、取200 uL 新鮮制備的感受態細胞，分別加入質粒DNA 2 uL（PET32a，IL-18），混勻，冰上放置30min。 
2、將EP管放到42℃ 保溫90s，冰浴 2min。 
3、加入800uL LB液體培養基，37℃慢搖復蘇1 h。 
4、將100 uL 的復蘇細胞涂布在含有Amp（100mg/mL）的LB培養皿中，正置平皿30min（使菌液被培養基吸收）。 
5、倒置平皿37℃培養16 h，出現菌落。 二、質粒的提取 
1 挑取單菌落接種于100 mL 加入50uL Amp 的LB液體培養基中，振蕩培養過夜。 
2 過夜培養的菌液加入1.5 mL的小指管（20個每組）中，每次1 mL，4℃，12000 rpm，離心1min，4次，棄上清。 
3 加入150uL溶液Ⅰ懸浮細胞，漩渦振蕩，室溫靜置10min。 
4 加入350uL溶液Ⅱ（新鮮配制），輕微顛倒混勻20次，冰浴5min。（不能再劇烈震蕩） 5 加入300uL溶液Ⅲ（冰上預冷），顛倒混勻20次，不能劇烈震蕩，冰浴10min。 6 4℃，12000 rpm，離心10 min，取上清轉移至另一離心管中。 7 向上清中加入0.6倍異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置20 min。 
8 4℃，12000 rpm，離心10 min，棄上清，倒扣于吸水紙上，吸凈液體。 
9 用1mL 70%乙醇洗滌質粒DNA沉淀2次，每次4℃，12000 rpm，離心3min，吸去上清。 10 55℃烘干至無酒精，加入20uL TE，所有集成一管后加入RNase 1~2uL，37℃消化1~2h，-20℃保存。 
11 電泳分析。制膠：0.14g瓊脂糖，20mL 1×TBE緩沖液，溶解后倒入制膠板，放入梳子，冷卻凝固待用。點樣：6uL質粒+1uL上樣緩沖液。電壓：180V，電泳至藍色帶距離點樣孔3cm

實驗三 目的基因質粒和表達載體質粒的酶切及其產物的分離純化 
【實驗步驟】

1 酶切

酶切體系 

試劑                       小量酶切                              大量酶切

滅菌水                        5uL                                    —

質粒                         10uL                                  88uL

EcoRⅠ                       0.5uL                                 1uL

HindⅢ                       0.5uL                                 1uL

10×Tango buffer             4uL                                   10uL

終體積                       20uL                                  100uL

按以上酶切體系加入0.5 mL EP管中，37℃放置3h，電泳回收片段。 （點樣：酶切體系100uL+上樣緩沖液20uL。）

2 酶切產物的回收 
1) 將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分放入干凈的離心管中，
稱取重量。 
2) 向膠塊中加入3倍體積溶膠液（如果凝膠重為0.1g，其體積可視為100uL，則加入300uL
溶膠液），50-55℃水浴放置10min，期間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解。 
注意：溶膠時，如果溶膠液變為紅色（正常情況下為淡黃色），可向含有DNA的膠溶液中加10-30uL 3N醋酸鈉（pH5.2）將溶液調為淡黃色，否則將會影響DNA與吸附柱的結合，影響回收效果。 
3) 將上一步所得的溶液加入一個吸附柱中（吸附柱放入收集管中），13，000rpm 離心
30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。 
注意：膠塊*溶解后將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因為吸附柱在較高溫度時結合DNA的能力較弱。 
4) 向吸附柱中加入700uL漂洗液（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），13，000rpm 離
心30-60s，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。 
5) 向吸附柱中加入500uL漂洗液，13，000rpm 離心30-60s，倒掉廢液。 
6) 將離心吸附柱放回收集管中，13，000rpm 離心2min，盡量出去漂洗液，將吸附柱開蓋
于室溫1-2min，*晾干，防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。 
7) 將吸附柱放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65-70℃預熱的洗
脫液，室溫放置2min。13，000rpm 離心2min收集DNA溶液。 8) DNA產物-20℃保存。 
完畢后電泳檢測回收與純化效果：DNA回收純化后，電泳檢測應為單一的一條帶，如果切膠過程中不慎帶上染帶，回收后電泳結果可能會出現兩條以上的帶，這時應重復上述方法進行回收與純化。 

實驗四 目的基因與表達載體的重組及重組子的篩選與鑒定 
【實驗步驟】 
1載體與目的基因的連接 
1) 在一1.5mL EP管中加入2uL酶切后的載體DNA與6uL目的DNA片段。 2) 添加1uL的10×buffer以及1uL的T4DNA連接酶，總體積10uL。 3) 16℃水浴條件下保溫過夜連接。 2感受態細胞與連接產物的轉化 1) 取感受態細胞BL21（實驗一制備） 200uL，加入6uL連接產物，輕輕用槍吹打混勻（不
可震蕩）。 2) 冰浴30min。 
3) 熱激：42℃保溫90S，冰浴2min。 
4) 加入800ul  LB培養基，37℃慢慢復蘇30min。

5) 將復蘇菌液4000r/min離心1min，先吸去800μL上清，再將細胞吹散成細胞懸液，取
50μL細胞懸液直接涂布在含氨芐青霉素（Amp）100ug/ml、X-gal和IPTG的LB選擇平板上。 
6) 將平板正向放置30min左右至液體被吸收，倒置平板37℃培養16—20h出現菌落，其
中白色為重組質粒。 
  3 重組子的鑒定（藍白斑篩選，小提質粒比大小和酶切分析） 
1）將白色單菌落接入3mL 含抗生素（Amp）的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。 2）按實驗二的方法提取質粒DNA，20uL RTE溶解DNA沉淀。 3）雙酶切質粒DNA 20uL 體系，方法同上。 
4）1%瓊脂糖凝膠電泳檢測重組質粒和它的酶切產物。 
（酶切鑒定重組子可見重組成功的重組子有兩個條帶：一為切為線性的PET32a質粒條帶，一為目的基因條帶。） 
實驗五 目的基因在大腸桿菌中的誘導表達及表達產物的SDS-PAGE分析 
實驗I 、外源基因在大腸桿菌中的誘導表達 
【實驗步驟】 
1. 分別挑取白斑菌落（重組菌株）、藍斑菌落（非重組菌株）于5ml 含AMP的LB液體培養基中，37℃，190r/min振蕩培養過夜(注意取菌株要在超靜工作臺上操作，一定注意無菌)。 2.分別取過夜培養菌1ml接種到5ml含AMP的LB液體培養基中（藍，白斑各3管，作好標記），于37℃搖床培養4h左右，達到1個OD值。 
3.因為誘導劑IPTG的量,誘導條件,誘導時間，培養基成分都可影響誘導表達，所以可按如下6組設計培養

4.分別取 6支試管按上述表格控制條件,搖瓶培養5h。 
5. 取1ml搖瓶后菌液于離心管，共6支，4℃低溫離心，12000 r/min，5 min，收獲菌體，棄上清，取沉淀（菌體可放-20℃存放備用）。 
6.向每支試管沉淀均加入200μL TE液，將細胞懸浮。 
7. 每管加入200μL  2 X SDS buffer。開水煮沸5min，再冰浴2min，4℃,12000 r/min，5 min，取上清液做凝膠電泳。

8.觀測結果及分析（實驗Ⅱ） 

實驗Ⅱ  SDS-PAGE檢測表達蛋白  

【實驗步驟】

1． 配制分離膠

分離膠配方  

雙蒸水   分離膠緩沖液       30%膠貯液       10%SDS        TEMED         10%AP 
6.7ML       5ML               8ML          200μL        15μL         150μL   

①按要求裝好膠板 ②按比例調好分離膠，混勻后加入兩玻璃夾縫中，到上口約2cm處，并小心在膠面上加入 1cm 蒸餾水，約 40 min，等膠自然凝聚后傾斜倒，出蒸餾水，并在兩玻璃板夾縫中水平插入 1.5 mm 的梳子(在膠面上加入蒸餾水稱水封，其目的是保持膠面平整和防止空氣進入，影響凝膠)。  
2.按配方配制好濃縮膠 
濃縮膠配方 雙蒸水 
濃縮膠緩沖
液 膠貯液 10%SDS TEMED 10%AP 6.1ML 2.5ML 1.3ML 100μL 15μL 75μL  
混勻后加入到分離膠上，并沒過梳子，待凝固后小心撥出梳子。

3．樣品制備 
菌體樣品與 2×上樣緩沖液 l:1 混勻，并在 100??C 沸水浴中保溫 3-5 min，取出待用。

4.點樣，電泳：開始電泳后，先恒壓80V，樣品進入分離膠后恒壓120V，至電泳帶跑到前沿后停止電泳。 
5.固定、染色、脫色：電泳完畢，將膠板從電泳槽中取出，小心從玻璃板上取下凝膠，將凝膠浸泡于染色液中染色30min左右，zui后加脫色液放到脫色搖床上脫色至區帶清晰為止。