轉錄組是某個物種或者特定細胞類型產生的所有轉錄本的集合，轉錄組測序(RNA-seq) 是zui近發展起來的利用深度測序技術進行轉錄分析的方法,可以對全轉錄組進行系統的研究。 

Roche GS FLX Titanium 、IlluminaSolexa GA IIx和AB SOLID 4均可以對轉錄組進行測序， Roche GS FLX Titanium與IlluminaSolexa GA IIx和AB SOLID 4相比，擁有更長的讀長和較小的數據量，適用于表達量較高基因的RNA全長測序。但是對低表達豐度的基因，可能需要多次測序才能得到足夠的數據，成本比較高 ，而IlluminaSolexa GA IIx和AB SOLID 4數據讀取量大，能夠得到較高的覆蓋率，可以較好的降低成本。若是位置基因組序列的物種，則Roche GS FLX Titanium測序更有優勢，其較長的讀長便于拼接，獲得更好的轉錄本數據。 

轉錄組測序可以供研究者在轉錄本結構研究（基因邊界鑒定、可變剪切研究等），轉錄本變異研究（如基因融合、編碼區 SNP研究），非編碼區域功能研究（Non-coding RNA研究、miRNA前體研究等），基因表達水平研究以及全新轉錄本發現等方面進行深入研究。  

1研究轉錄組的方法有哪些？ 

答：目前研究轉錄組的方法主要三種，基于雜交技術的cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片，基于sanger測序法的SAGE (serial analysis of gene expression)、LongSAGE和MPSS(massively parallel signature sequencing)，基于第二代測序技術的轉錄組測序，又稱為RNA-Seq。  

2轉錄組測序比其他研究方法有哪些優勢?

答：轉錄組測序具有以下優勢：

（1）可以直接測定每個轉錄本片段序列、單核苷酸分辨率的準確度，同時不存在傳統微陣列雜交的熒光模擬信號帶來的交叉反應和背景噪音問題；（2）靈敏度高，可以檢測細胞中少至幾個拷貝的稀有轉錄本；（3）可以對任意物種進行全基因組分析，無需預先設計特異性探針，因此無需了解物種基因信息，能夠直接對任何物種進行轉錄組分析，同時能夠檢測未知基因，發現新的轉錄本，并準確地識別可變剪切位點及cSNP，UTR區域。（4）檢測范圍廣，高于6個數量級的動態檢測范圍，能夠同時鑒定和定量稀有轉錄本和正常轉錄本。  

3轉錄組測序有什么樣的樣品要求？

答： （1） 樣品純度要求： OD值應在1.8至2.2之間；電泳檢測28S:18S至少大于1.8。 （2）樣品濃度： total RNA濃度不低于400 ng/μg。 （3）total RNA樣品請置于-20℃保存；請提供total RNA樣品具體濃度、體積、制備時間、溶劑名稱及物種來源。請同時附上QC數據，包括電泳膠圖、分光光度或Nanodrop儀器檢測數據。 （4）樣品請置于1.5 ml管中，管上注明樣品名稱、濃度以及制備時間，管口使用Parafilm封口。建議使用干冰運輸，并且盡量選用較快的郵遞方式，以降低運輸過程中樣品降解的可能性。  

4mRNA的純化分離方法？ 

答：進行mRNA研究中，首先需要對樣本進行總RNA抽提，抽提得到的RNA除含有mRNA外，還含有rRNA和tRNA，為防止這兩類RNA對轉錄組研究的影響，因此我們需要對mRNA進行分離純化。真核細胞的mRNA分子zui顯著的結構特征是具有5’端帽子結構（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數哺乳類動物細胞mRNA的3’端存在20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結構為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。 mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法zui為有效，已成為常規方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。  

5、使用Solexa進行轉錄組測序時，樣本RNA如何進行片段化處理？ cDNA插入片段長度的選擇？ 

答：Solexa轉錄組測序文庫構建時采用的打斷Buffer對RNA樣本進行片段化處理，這種方法充分利用RNA對二價陽離子的敏感性，具有穩定性好的優點，通過這種方法打斷能得到更加均勻的覆蓋率。mRNA-seq可以既可以采用單端測序（single read） 還可以采用雙端測序（ paired end），對于單端測序來說片段長度150-200bp是理想的長度范圍，對于雙端測序來說片段長度推薦300-500bp，由于兩端加入了Solexa的錨定序列和引物序列，樣品準備完成后所獲得的產物長度比插入的cDNA長度要長。  

6、文庫準備過程中，反轉錄引物的選擇？ 

答：在進行cDNA合成過程中，經常用到的有兩種引物：oligodT引物和隨機引物。 
在RNA反轉錄過程中使用oligodT引物進行擴增可以保證擴增產物包括mRNA的3'末端，減少rRNA的干擾，但是采用oligodT 引物擴增有一個問題，就是擴增片段的長度偏短和擴增產物所包含的信息量偏向3’端的問題，之所以有長度偏短，一方面與RNA完整性有關，但zui重要的限制在于逆轉錄酶的延伸能力。 用oligodT 引物擴增出來的片段長度短，雖然都有mRNA的3'端，但是序列信息多位于3'-UTR附近，若擴增序列太短，則有用信息很少，不利于序列的識別和分析。 
使用Random primer擴增，雖然擴增偏短長度也很短， 但是由于它的逆轉錄并不一定在mRNA的末端起始，而是在隨機位置起始，所以它的擴增片段帶有更多CDS的信息，但是如果是用總RNA逆轉錄的話，有可能會受到rRNA的干擾。 
采用Solexa進行轉錄組測序，測序文庫準備過程中，由于實驗之前已經采用oligodT微磁珠進行純化，而且mRNA已經進行了片段化處理后才進行反轉錄，因此反轉錄只能采用隨機引物進行cDNA的合成，如果采用oligodT進行擴增，只能得到mRNA的3'端序列，無法得到完整的mRNA序列。 
 

7、 Solexa進行轉錄組測序，測序文庫的制備方法及質控標準？ 

答：首先會樣本進行質量檢測，檢測合格后，對樣本進行測序前處理，構建測序文庫，構建步驟為：（1）首先利用oligodT微珠純化mRNA；（2）將純化得到的mRNA進行片段化處理；（3）利用逆轉錄酶反轉錄合成cDNA*鏈；（4）以cDNA*鏈為模板合成雙鏈cDNA；（5）對雙鏈cDNA進行末端修復并在3’末端加’A”；（6）在DNA片段的兩端連接上特定的測序接頭；（7）割膠純化連接好的cDNA片段（一般回收200-500bp之間的片段）；（8）利用高保真聚合酶擴增測序文庫；（9）檢測測序文庫。對于測序文庫，需要進行質量控制，一般通過 Aligent Technologies 2100分析儀和電泳觀察兩種方法檢測測序文庫的大小，純度及濃度。

8、轉錄組測序結果的影響因素？ 

答：RNA的降解嚴重影響測序的質量，RNA降解后，加入poly-A后無法捕獲純化mRNA，因此，隨機引物反轉錄無法得到全部的cDNA，導致測序結果出現明顯的3‘-和5’-偏向。文庫中的poly-A多聚物的存在會對測序信號產生干擾，影響測序結果的準確性；同時由于轉錄組中轉錄本的豐度不一致，實驗前需要對樣本進行均一化處理，否則高豐度的表達基因會掩蓋低豐度表達基因，導致尋找新基因失敗或者是獲得大量無意義的重復序列。  

9、轉錄組測序需要多大的測序量才能得到有意義的結果？ 

答：轉錄組測序前，需要對物種轉錄組的大小進行評估，評估方法如下： （1）對于有reference genome的物種，可以分析基因組信息，統計編碼基因的個數，及其堿基數，從而估計物種轉錄組的大小，另外可以查詢相關或相近物種轉錄組研究的文獻，作為參考。 
（2）對于無reference genome的物種則只能參考相近物種的轉錄組大小。 
由于轉錄組需要進行表達量的分析，因此在轉錄組測序中不推薦覆蓋度，在進行不同基因和不同實驗間的基因表達差異分析時，人們提出了RPM和RPKM的概念。 RPM（Reads Per Million reads）即每百萬reads中來自于某基因的reads數，考慮了測序深度對讀段計數的影響。RPKM（Reads Per Kilo bases per Million reads）是每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數。因此，在確定轉錄組的測序量時，以產生的讀長數目做依據，參照轉錄組大小，估計需要的讀長數目，來確定轉錄組需要的測序量。  

10、如何處理轉錄組測序中存在的系統噪音和偏差？ 

答：雖然深度測序技術的準確性較以前的技術有了很大提高，但仍然存在錯誤和噪聲。比如內含子區內有一些不連續的reads，很可能由系統噪聲造成，如樣品污染、測序錯誤和不恰當的read定位策略等。另外，外顯子區域內的read信號分布有時也很不均勻。有文獻報道，序列組成尤其是GC含量、RNA二級結構等也有可能是導致read不均勻分布的原因。這些噪聲和分布偏好將影響新基因的識別和對剪接異構體形式和表達水平推斷。 合理地建模RNA-seq數據中的系統噪聲和偏好是解決上述問題zui有效的辦法。基本的思路可以是：首先根據實驗原理尋找可能產生系統噪音或偏差的因素，并盡可能將這些因素轉化成可量化的特征，如序列特征、二級結構等；然后，將用實驗數據對這些特征做統計分析，構造和訓練模型，用模型來對數據進行校正。需要注意的是，某些偏好是由當前的測序技術和分析方法共同造成的，難以*消除。在這種情況下，后續處理和解釋時需要充分意識到這種偏好可能對生物學結論帶來的影響，必要時通過補充其他實驗來驗證和修正通過高通量測序得到的生物結論。