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【LNP/AAV】藥物載體的生物物理表征方法
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【LNP/AAV】脂質載體的生物物理表征方法
利用光散射和量熱技術對用于疫苗和治療的病毒和脂質載體進行生物物理表征
作者：Natalia Markova, Stefan Cairns, Hanna Jankevics-Jones, Michael Kaszuba, Fanny Caputo and Jérémie Parot
近期，馬爾文帕納科應用科學家和挪威SINTEF工業生物技術和納米醫學部的科學家們在Vaccines雜志上發表一篇名為《利用光散射和量熱技術對用于疫苗和治療的病毒和脂質體進行生物物理表征》的文章。
文章對多種用于新型疫苗研發制造的病毒或非病毒載體的表征方法做了專業的介紹。文中所述多種無標記生物物理技術作為互補的分析工具可廣泛用于AAV 和LNP的設計、表征和質量控制。且已經成功的用于表征AAV和LNP等藥物載體的物理、化學屬性，本文將對該項研究做簡要介紹。
原文：Vaccines 2022, 10, 49
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引言
病毒載體和脂質納米顆粒（LNP）的結構復雜性影響其功能和藥物配方的成功性。這類分子被用作核酸（mRNA，DNA）的遞送平臺后，如何準確表征這些顆粒變得越來越重要。
在設計、產品開發和過程控制中，理化屬性的表征和質量控制需要選擇合適、互相補充的分析工具。選擇合適的技術來監測樣品需要考慮載體的性質、測量處于產品開發的哪個階段、以及測量的目的?？煽康臏y量結果和對數據的充分解析依賴深厚的方法學專業知識和全面的數據分析方法。
這里，我們將介紹如何通過綜合使用互相補充的、非標記生物物理技術，包括動態光散射（DLS）、多角度光散射（MADLS）、電泳光散射（ELS）、納米顆粒跟蹤分析（NTA）、多檢測器SEC和差示掃描量熱法（DSC），表征包裹mRNA的病毒載體和LNPs的理化屬性。
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樣品
使用病毒和非病毒載體樣品，包括包裹mRNA的脂質納米顆粒（mRNA-LNPs），脂質體和腺相關病毒（AAV）。
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測量內容與檢測技術
Zetasizer Ultra
Zetasizer Ultra 納米粒度及電位分析儀
Zetasizer Ultra 是快速而準確地測量顆粒和分子大小、顆粒電荷以及顆粒濃度的伴侶，其擁有用于高分辨率粒度測量切角度無關的多角度動態光散射（MADLS）技術可以更深入地展現樣品的顆粒分布，電泳光散射（ELS）技術可用于測量顆粒和分子的Zeta電位，以顯示樣品的穩定性和/或團聚傾向性?？梢杂糜趓AAV 顆粒的粒徑及衣殼滴度的表征。
NanoSight NS300
Nanosight NS300 納米顆粒跟蹤分析儀
采用納米粒子跟蹤分析 (NTA) 技術，馬爾文帕納科NanoSight 這種技術利用光散射和布朗運動的特性，獲得納米顆粒大小 0.01 - 1µm及顆粒濃度，以及實時表征蛋白質聚合(聚集)的解決方案。這使得 NTA成為病毒疫苗研究、納米毒物學和生物標志物檢測以及疾病狀態研究的細胞外囊泡、外泌體表征的重要技術。
MicroCal PEAQ DSC
MicroCal PEAQ DSC差示掃描量熱儀
差示掃描量熱法（DSC）是一種功能強大的分析技術，用于表征和分析蛋白質和其他生物分子的熱穩定性。
OMNISEC
OMNISEC 尺寸排阻色譜儀
OMNISEC是個多檢測器SEC系統，包括示差檢測器（RI）、紫外檢測器（UV）、光散射檢測器（LS）和粘度檢測器（IV）?？梢杂糜诒碚骱脱芯扛街谥|納米顆粒顆粒遞送載體上的藥物量以及產品的分子量和結構。
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測量案例展示
粒徑分布測量
使用DLS、MADLS、NTA和SEC-SLS/UV/RI測量不同大小、不同粒徑分布的樣品。
樣品：圖A/B LNP1，C/D LNP2，E/F 脂質體，G/H AAV
顆粒濃度測量
使用MADLS、NTA和SEC-SLS/UV/RI。需要根據載體大小選擇合適的技術，這也決定了可測量的濃度范圍。
Zeta電位測量
Zeta電位可用于測量粒子在緩沖液/培養液中的電荷。下例是使用Zetasizer選配的MPT3滴定儀評估樣品在pH 2.5-9.5范圍內的行為。樣品LNP1和LNP2的區別僅在于使用的可電離脂質不同，在pH 4.5-7區間可見二者的差異。
有效載荷比測量
使用SEC-SLS/UV/RI測量LNPs內mRNA的比率。
樣品：a) LNP1；b) LNP2
熱穩定性
下述DSC熱譜圖分別是（A）同一個LNP2樣品取2份進行測量，展示了測量良好的可重復性（B）對比不同批次LNP2，結果差異較大（C）溶液中游離mRNA的結構轉變和部分可逆性。
主要結論
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互補和正交的分析技術是驗證和/或洞察樣品行為的重要工具。
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測量顆粒大小和濃度時，選擇何種分析方法主要取決于載體的大小和粒度分布。同時，分析的目的也會影響分析方法的選擇，比如是想了解樣品自上一步驟以來是否發生了變化，還是樣品中存在哪些低聚形態，每種形態占比多少？
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Zeta電位可提供樣品在緩沖液中的電荷信息，或是如本文案例中，用于了解使用不同脂質體的樣品在一定pH范圍內的差異。
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使用SEC-SLS/UV/RI系統的光散射和雙濃度檢測器進行樣品的分離和分析，可分別量化脂質體和mRNA，如本文中測量的LNP中的mRNA質量百分比。
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DSC可用于研究復雜LNP體系及其中組分如mRNA的熱誘導結構轉變。DSC熱譜圖可用作定性和定量的指紋圖譜，用于樣品批次一致性的分析。