色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相中的各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，由于與固定相發(fā)生作用(吸附、分配、排阻、親和)的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱(chēng)為色層法、層析法。
高效液相色譜法的應(yīng)用范圍十分廣泛，對(duì)樣品的適用性廣，不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，幾乎所有的化合物包括高沸點(diǎn)、極性、離子型化合物和大分子物質(zhì)均可用高效液相色譜法分析測(cè)定，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機(jī)化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來(lái)分析。
與氣相色譜不同的是液相色譜中流動(dòng)相亦參與組分的分離過(guò)程，其組成、比例和pH值可靈活調(diào)節(jié)，分離模式多樣。在實(shí)際操作中主要通過(guò)改變流動(dòng)相的組成來(lái)調(diào)節(jié)樣品在色譜柱的保留值和選擇性，從而使不同樣品得到分離。
HPLC色譜對(duì)流動(dòng)相的一般要求，常見(jiàn)故障及維護(hù)：
流動(dòng)相就比如人體的血液，其質(zhì)量直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的正常運(yùn)行與否。
應(yīng)該使用HPLC級(jí)的溶劑，不能互相混溶的溶劑不可以直接切換！一般在水相和與其不混溶的溶劑切換時(shí)，使用異丙醇作為過(guò)渡溶劑。
注意溶劑的截止波長(zhǎng)。截止波長(zhǎng)是指該溶劑可以在紫外檢測(cè)器中使用的低波長(zhǎng),低于該波長(zhǎng)后,溶劑會(huì)有很強(qiáng)的紫外吸收，從而影響極限的穩(wěn)定性、干擾對(duì)所分析物質(zhì)的檢測(cè)。
HPLC所使用的水必須是新鮮的和經(jīng)過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾過(guò)的。建議每天更換新鮮的水。長(zhǎng)期不用時(shí)，必須把使用水的管路用有機(jī)溶劑置換，防止長(zhǎng)霉。
儀器使用完后要采用適當(dāng)?shù)娜軇_洗等方法維護(hù)色譜柱和系統(tǒng)。如果使用了緩沖鹽一定先將鹽要沖洗干凈。
儀器長(zhǎng)期不用時(shí)，不建議使用純乙腈封存。因?yàn)橐译嬗猩删酆衔锏内厔?shì)。建議使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。
當(dāng)有流路堵塞時(shí)，可以嘗試將之反接后沖洗。污染的溶劑或溶劑瓶里的藻類(lèi)生長(zhǎng)將會(huì)縮短溶劑過(guò)濾器的使用壽命，并且影響泵和系統(tǒng)的的性能。這在水溶劑或磷酸鹽緩沖液(pH4至7)中尤其如此。
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