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導讀

l                      梯度延遲體積概念及對分析的影響

2023年4月，國家藥典委員會發布“關于通則0512高效液相色譜法修訂草案的公示（第一次）”。2023年9月，國家藥典委員會發布“關于通則0512高效液相色譜法修訂草案的公示（第二次）”。

在公示稿中，提到如梯度微調后仍不能滿足系統適用性要求，通常應考慮滯留體積（也稱延遲體積）的緣故或更換色譜柱。

梯度延遲體積：是指從流動相混合點至柱入口之間的體積，影響延遲體積的參數包括泵、混合器，進樣器，最后到色譜柱，以及連接系統各部件的接頭。梯度洗脫中延遲體積非常重要，特別是復雜樣品的分析，低的延遲體積具有更快的梯度響應時間，同一樣品在同一色譜柱上能夠獲得更好的分辨率。

若在實際使用中與方法開發時延遲體積有較大差異，會顯著影響梯度響應時間，從而導致色譜分析中分離度、保留時間、相對保留時間受到顯著影響。如在中藥特征圖譜、一標多測項目中相對保留時間作為常見評價指標，若相對保留時間超出規定值范圍，可以將延遲體積差異作為考慮因素。

l                      中國藥典、歐洲藥典及美國藥典解決思路

在本次公示稿中，提到應考慮方法開發時的系統與實際使用系統之間滯留體積的差異，在開始梯度程序前增加一個等度平衡階段，通過調整等度階段時間來調整梯度時間點，以與所使用的分析設備相適應。

美國藥典與歐洲藥典在液相色譜法通則中均提到梯度延遲體積對梯度分析的影響，解決思路各國藥典保持一致。

延遲體積解決辦法

1. 選擇延遲體積接近的儀器，但標準制定時系統往往是未知的。

2. 更換硬件配置，但操作較為繁瑣。

3. 截止進樣功能，島津液相色譜工作站內置設置截止環模式，操作簡便。

4. 調整梯度起點功能，島津液相色譜工作站可選擇進樣前和進樣后兩種模式，操作簡便。

典型應用案例

1、梯度起始點調整（進樣前）  遠志配方顆粒特征圖譜

從遠志配方顆粒驗證結果看，標準模式下，峰4實測RRT偏差大于標準要求的±10%。梯度起點調整（進樣前500 µL）后，峰4實測RRT偏差小于±10%，且其他峰結果更優。

2、梯度起始點調整（進樣后）  野菊花配方顆粒特征圖譜

標準模式下，實測RRT偏差在 -9.77~0.24%之間。梯度起點調整后，實測RRT偏差在 -6.74~0.12%之間，RRT得到改善。

3、截止環功能進樣   首烏藤配方顆粒特征圖譜

正常進樣條件下，峰1的RRT大于10%，使用截止環進樣后所有峰的RRT均在±10%之內，符合標準要求。

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